葡萄糖對(duì)絨山羊精子冷凍保存及代謝的影響

栗瑞蘭，張 通，劉志紅，2,3，王瑞軍，2,3，李金泉,2,3*，張家新,2,3*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，呼和浩特 010018)

家畜精液冷凍保存技術(shù)是一項(xiàng)重要的動(dòng)物繁殖技術(shù)，近10多年，精液冷凍保存技術(shù)已得到長足的發(fā)展。隨著精液冷凍技術(shù)的不斷優(yōu)化[1-4]，牛、山羊和綿羊的冷凍精液在生產(chǎn)中也得到廣泛的應(yīng)用。精子在冷凍-解凍過程中受到冷凍應(yīng)激，使精子活力降低、質(zhì)膜損傷以及DNA結(jié)構(gòu)破壞。DNA損傷主要由冷凍過程中氧化應(yīng)激導(dǎo)致的[5-6]。精子的生存和運(yùn)動(dòng)依賴糖酵解和線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)提供能量，在此過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，這些多余的ROS會(huì)在精子或精清中抗氧化酶的作用下被去除，如果缺乏抗氧化酶或抗氧化體系被破壞，就會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。

山羊精子能夠利用葡萄糖、果糖、乳糖和其它糖進(jìn)行代謝，而且可利用的濃度(6～375 mmol·L-1)范圍較大[8]。其中小分子糖(葡萄糖和果糖)研究較多。葡萄糖是比較適合山羊精子代謝的底物，給精子提供能量以維持正常的生理活動(dòng)和功能[8-9]。在冷凍過程中因處理方式不同，添加葡萄糖濃度也不同。然而，在絨山羊精液冷凍保存過程中，關(guān)于葡萄糖對(duì)精子代謝影響的報(bào)道較少。

葡萄糖通過精子的質(zhì)膜，利用糖酵解或三羧酸循環(huán)(TCA)為精子提供能量[10]。哺乳動(dòng)物精子獲取能量的方式受諸多因素的影響，例如稀釋液的成分、溫度等。在液態(tài)保存山羊精液的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫條件下精子主要依賴葡萄糖通過糖酵解為精子提供能量[11]，但是糖酵解產(chǎn)物乳酸的積累會(huì)導(dǎo)致精子周圍環(huán)境的改變，進(jìn)而影響精子的生存[12-13]。

在本研究中，從冷凍-解凍后的精子活力、運(yùn)動(dòng)速率、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及代謝等方面，比較了不同濃度葡萄糖對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍保存的影響，為提高絨山羊精液冷凍保存效果及闡明絨山羊精子抗凍機(jī)制提供一些實(shí)踐與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Tris、檸檬酸-水合物、葡萄糖、乳酸和甘油均購于Sigma公司，雙抗購于Gibco公司，Annaxin V/PI試劑盒購于BD生物技術(shù)公司，PNA-FITC購于上海哈靈生物技術(shù)公司, ATP檢測試劑盒(S0026)、DCFH-DA(S0033)購于碧云天生物技術(shù)公司，吖啶橙(A8120)、丙酮酸(PA)含量檢測試劑盒(BC2205)、乳酸(LA)含量檢測試劑盒(BC2230)均購于索萊寶生物技術(shù)公司。

1.2 精液采集

精液采自6只(2～4歲)健康的、具有正常繁殖能力的公絨山羊。用假陰道法采集精液后，立即進(jìn)行品質(zhì)檢測和處理。將鮮精密度達(dá)到200×107·mL-1，活力≥85%的精液在35 ℃下進(jìn)行混合。冷凍稀釋液成分[1]為300 mmol·L-1tris、95 mmol·L-1檸檬酸-水合物、1%雙抗、10%卵黃(v/v)和5%甘油(v/v)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)在此基礎(chǔ)上添加不同濃度葡萄糖0、28、56、84和112 mmol·L-1。

1.3 精液冷凍

混合后的精液用等溫的冷凍液按體積比為1∶5在試管中進(jìn)行一步稀釋，之后水浴，置于5 ℃冰箱2 h， 取平衡后的精液立刻分裝于0.25 mL冷凍細(xì)管中，封管。置于5 ℃冰箱平衡30 min。在距離液氮液面上4 cm處熏蒸7 min， 投入液氮中冷凍保存。冷凍精液保存3 d，解凍:將凍精細(xì)管置于38 ℃水浴中30 s[14]。

1.4 精子質(zhì)量檢測

1.4.1 精子運(yùn)動(dòng)檢測 冷凍精液解凍后，將精子懸浮液滴于專用精子計(jì)數(shù)板中，放置在37 ℃恒溫臺(tái)上，利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(computer-assisted sperm analysis system——CASA，Minitube德國)，分別檢測冷凍-解凍后精子的活力、運(yùn)動(dòng)速率包括曲線速率(VCL)、直線速率(VSL)和平均路徑速率(VAP)。

1.4.2 精子結(jié)構(gòu)檢測 將解凍后的精液，加入適量PBS洗滌，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清。調(diào)整精子密度為120×105·mL-1，按照PNA-FITC試劑盒說明操作染色20 min后，洗滌，之后加入10 μL PI染色5 min，洗滌，然后進(jìn)行精子頂體完整率檢測；在上述精子密度下，參考趙娜等[15]檢測方法，利用Annaxin V/PI檢測精子膜的完整性；在同樣精子密度下，用10 μmol·L-1吖啶橙染液避光染色 15 min，檢測精子DNA的完整性。流式細(xì)胞儀(ACEA NovoCyteTM)檢測時(shí)，采集2萬個(gè)精子細(xì)胞。PNA-FITC/PI染色后，統(tǒng)計(jì)Q2-1(PI+-PNA-)和Q2-3(PI--PNA-)，為完整頂體的精子比率；Annaxin V/PI染色后，統(tǒng)計(jì)Q2-3(PI--Annexin V-)為完整質(zhì)膜的精子比率；吖啶橙染色后，統(tǒng)計(jì)綠色熒光的精子比率。

1.5 精子中ROS和Ca2+的檢測

將解凍后的精液加入適量PBS洗滌，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，調(diào)整精子密度為120×105·mL-1。用ROS檢測試劑盒，檢測ROS水平，洗滌后的精子加入1 mL不加卵黃和甘油的稀釋液，加入10 μmol·L-1DCFH-DA，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育30 min，每隔5 min輕輕顛倒混勻，之后PBS洗滌3次，PBS重懸，取200 μL進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測其熒光值，其中,熒光強(qiáng)度=熒光值A(chǔ)(DCFH-DA)-熒光值B(細(xì)胞自發(fā)光)，剩余部分用PI染色后熒光顯微鏡觀察。

檢測精子細(xì)胞中游離Ca2+水平，洗滌后的精子加入PBS懸浮調(diào)整濃度為120×105·mL-1，加入5 μmol·L-1Fluo-3 AM，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱避光孵育60 min，離心去上清，加入PBS懸浮繼續(xù)孵育30 min，洗滌兩次，PBS重懸，取200 μL用流式細(xì)胞儀檢測其熒光值，其中，熒光強(qiáng)度=熒光值A(chǔ)(Fluo-3 AM)-熒光值B(細(xì)胞自發(fā)光)，剩余部分用PI染色后熒光顯微鏡觀察。

1.6 ATP、丙酮酸(PA)和乳酸(LA)的檢測

將解凍后的精子細(xì)胞加入PBS進(jìn)行洗滌，1 000 r·min-1離心3 min，去除上清，收集細(xì)胞，加入500 μL ATP提取液，超聲破碎后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。按照ATP檢測試劑盒操作說明，多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值；解凍的懸浮液離心后收集，按照丙酮酸和乳酸檢測試劑盒操作說明，多功能酶標(biāo)儀檢測吸光值；BCA法檢測各個(gè)樣品的總蛋白濃度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SAS9.0軟件中的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖對(duì)絨山羊精子冷凍-解凍后活力和速率的影響

稀釋液中添加不同濃度的葡萄糖，絨山羊精液冷凍-解凍后精子活力和速率如圖1。在添加56 mmol·L-1濃度條件下，精子活力顯著高于其他濃度(P<0.05)，0(對(duì)照組)、28和84 mmol·L-1組之間沒有差異，112 mmol·L-1組活力顯著下降(P<0.05)(圖1A)；在速率檢測中，28、56和84 mmol·L-1組的VCL和VAP都顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，VSL無顯著差異；而112 mmol·L-1組的精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)速率都顯著降低(P<0.05)(圖1B)。

2.2 葡萄糖對(duì)絨山羊精子冷凍-解凍后DNA完整性、頂體完整性和質(zhì)膜完整性的影響

絨山羊精子冷凍-解凍后細(xì)胞結(jié)構(gòu)及檢測結(jié)果見圖2。添加不同濃度葡萄糖檢測精子頂體、質(zhì)膜和DNA完整性(圖2B～D)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2E～G，冷凍-解凍后精子DNA完整性各組無顯著性差異(圖2E)，而且DNA完整率均達(dá)到83%以上。在28、56和84 mmol·L-1組中頂體和質(zhì)膜完整性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；112 mmol·L-1組與對(duì)照組之間無顯著差異(圖2F～G)。

上標(biāo)不同小寫字母表示不同濃度組間差異顯著，P<0.05。下同Different superscripts (a, b, c, d) indicated the significant difference among different concentration groups, P<0.05.The same as below圖1 絨山羊精子解凍后活力(A)和速率(B)Fig.1 The motility (A) and velocity (B) in frozen-thawed sperm of cashmere goat

2.3 葡萄糖對(duì)絨山羊精子中ROS和Ca2+水平的影響

DCFH-DA對(duì)冷凍解凍后絨山羊精子中ROS進(jìn)行特異性染色(圖3a1、b1、c1)，PI對(duì)死精子進(jìn)行特異性染色，死精子和活精子均會(huì)產(chǎn)生ROS，在活精子的線粒體鞘和頭部均檢測到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。由圖3C可知，在56 mmol·L-1葡萄糖濃度下，精子細(xì)胞中ROS水平極顯著高于其他組(P<0.01)。Fluo 3-AM對(duì)冷凍-解凍后精子Ca2+特異性染色(圖3a2、b2、c2)，在精子線粒體鞘和部分精子的頂體檢測到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。由圖3D可知，在28和56 mmol·L-1葡萄糖濃度下，精子細(xì)胞中Ca2+水平極顯著低于其他組(P<0.01)。

2.4 絨山羊精子中ATP以及懸浮液中乳酸(LA)和丙酮酸(PA)濃度以及乳酸對(duì)精子活力的影響

冷凍-解凍后精子細(xì)胞中ATP濃度如圖4A所示，與對(duì)照組相比，添加葡萄糖后，精子中ATP濃度極顯著升高，其中56和84 mmol·L-1組的ATP極顯著高于其他組(P<0.01)。精液冷凍-解凍后，精子懸浮液中的丙酮酸濃度見圖4B，結(jié)果表明，丙酮酸濃度隨著葡萄糖濃度的增加而升高，但112 mmol·L-1組與84 mmol·L-1組相比卻顯著下降(P<0.05)。

精子懸浮液中的乳酸濃度見圖4C，在低濃度葡萄糖組(28和56 mmol·L-1)中未檢測到乳酸，而84 mmol·L-1組檢測到微量乳酸((0.003±0.001)μmol·mg-1總蛋白)，112 mmol·L-1組檢測到大量乳酸((0.513±0.102)μmol·mg-1總蛋白)。為了進(jìn)一步分析乳酸對(duì)精液冷凍保存的影響，在含有56 mmol·L-1葡萄糖的稀釋液中添加不同濃度的乳酸，精液冷凍-解凍后精子活力結(jié)果見圖4D。與對(duì)照組相比，添加不同濃度的乳酸后，精子活力均顯著下降(P<0.05)。

3 討 論

在精子發(fā)生過程中，大部分胞質(zhì)從精子上分離，因此成熟精子缺乏細(xì)胞質(zhì)成分，只能利用精清或環(huán)境中的物質(zhì)進(jìn)行分解代謝，必要時(shí)也可以分解自身的能量物質(zhì)來獲取能量。精子代謝產(chǎn)生的能量，大部分維持其運(yùn)動(dòng)能力，剩余部分用于維持正常的生理特性，如維持質(zhì)膜完整性。當(dāng)環(huán)境中缺乏能量物質(zhì)時(shí)，若不能及時(shí)得到補(bǔ)充，精子將會(huì)因能量的耗竭而喪失生存能力[16]。

葡萄糖是精子代謝過程可利用的主要底物之一，也是比較適合山羊精子代謝的底物[8-9]，本研究中，在冷凍稀釋液中添加不同濃度的葡萄糖(0、28、56、84、112 mmol·L-1)，發(fā)現(xiàn)添加56 mmol·L-1葡萄糖更有利于絨山羊精子的冷凍保存，冷凍-解凍后的精子活力可達(dá)到69.79 %。但添加高濃度的葡萄糖(112 mmol·L-1)則不利于絨山羊精子的冷凍保存，冷凍-解凍后的精子活力顯著下降。Salamon和Ritar[17]在山羊精子的研究中也表明，精液冷凍效果隨著葡萄糖濃度的升高而降低。在Naing等[9]的研究中，在去除精清的條件下，將精子冷凍保存于含有69.38 mmol·L-1葡萄糖的冷凍液中，冷凍-解凍后總活力為60.5 %；而Kü?ük等[1]的研究中，將精液直接稀釋于含有28 mmol·L-1葡萄糖的冷凍液中，解凍后活力為47.50%。說明在不同處理?xiàng)l件下，冷凍稀釋液中添加合適濃度葡萄糖對(duì)山羊精液的冷凍保存具有重要作用。在速率檢測中發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的葡萄糖(28～84 mmol·L-1)能夠顯著提高精子冷凍-解凍后的運(yùn)動(dòng)速率，這與人精子的研究結(jié)果一致[18]。另外，在冷凍-解凍后精子形態(tài)檢測中發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖能夠顯著提高精子頂體和膜的完整性。說明葡萄糖在維持冷凍-解凍后山羊精子的活力、速率和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性具有重要的作用。

A.精子細(xì)胞群。B.PNA-FITC/PI熒光染色：Q1.完整頂體、質(zhì)膜損傷的精子細(xì)胞；Q2.頂體損壞、質(zhì)膜損傷的精子細(xì)胞；Q3.完整頂體、質(zhì)膜完整的精子細(xì)胞；Q4.頂體損壞、質(zhì)膜完整的精子細(xì)胞。C.PI/Annexin V-FITC熒光染色：Q1.膜損傷的死亡精子細(xì)胞；Q2.膜損壞的死亡精子細(xì)胞；Q3.完整膜的活精子細(xì)胞； Q4.膜完整的凋亡精子細(xì)胞。D.Acridine Orange熒光染色，右圖靠近縱軸的是DNA完整的精子細(xì)胞群，靠近橫軸是DNA斷鏈或解旋的精子細(xì)胞；左圖是在熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光(左上圖)為DNA完整，橘色熒光(左下圖)是DNA斷鏈或解旋(400×)。E.精子DNA完整性分析；F.頂體完整性分析；G.質(zhì)膜完整性分析A. Spermatozoa. B. PNA-FITC/PI fluorescent staining：Q1. Sperm with damaged plasma membrane and intact acrosome; Q2. Sperm damaged plasma membrane and damaged acrosome;Q3. Sperm with intact plasma membrane and intact acrosome; Q4. Sperm with intact plasma membrane and damaged acrosome. C. PI/Annexin V-FITC fluorescent staining: Q1. Dead sperm with a damaged plasma membrane; Q2. Apoptotic sperm with a damaged plasma membrane;Q3. Viable sperm with a intact plasma membrane; Q4. Apoptotic sperm with a intact plasma membrane. D. Acridine Orange fluorescent staining. The right panel shows sperm with a intact DNA close to the vertical axis, sperm with damaged DNA close the horizontal axis. The left panel is observed under a fluorescence microscope， Green fluorescence (upper left) is intact DNA, orange fluorescence (below left) is DNA damaged(400×). E. Statistics of DNA integrity; F.Statistics of acrosome integrity; G. Statistics of membrane integrity. Different superscript indicate the significant difference among different concentration groups,P<0.05. The same as below圖2 冷凍解凍后精子的頂體完整性、質(zhì)膜完整性和DNA完整性分析Fig.2 Acrosomal integrity, integrity of plasma membrane and DNA integrity of frozen-thawed sperm

對(duì)于哺乳動(dòng)物精子三磷酸腺苷(ATP)的主要來源是糖酵解和線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)[19-20]。在糖酵解過程中，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞中經(jīng)過一系列反應(yīng)最終生成丙酮酸。丙酮酸可以被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸，也可以進(jìn)入線粒體進(jìn)行TCA循環(huán)產(chǎn)生大量能量[9,21]。在本試驗(yàn)中，精液冷凍-解凍后，在一定的葡萄糖濃度(28～84 mmol·L-1)，精子懸浮液中丙酮酸隨著冷凍稀釋液中添加葡萄糖量的增加而增加。但是冷凍稀釋液中添加低濃度葡萄糖(0～56 mmol·L-1)的精子懸浮液中未檢測到乳酸，而高濃度葡萄糖組(112 mmol·L-1) 的精子懸浮液中卻存在大量乳酸。這種大量乳酸的存在可能是兩方面的原因所致，首先隨著葡萄糖濃度的增加，由于糖酵解的作用而使乳酸濃度增加，而且低溫環(huán)境下，精子代謝主要以糖酵解為主[11]；其次，精液解凍后，隨著溫度的升高，精子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，糖酵解產(chǎn)生的能量不足以維持精子的運(yùn)動(dòng)和功能，精子代謝方式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄癁橹鱗22]，使糖酵解產(chǎn)物乳酸在乳酸脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)入細(xì)胞線粒體發(fā)生OXPHOS產(chǎn)生更多ATP，以維持精子的正常功能。但是高濃度的葡萄糖使線粒體中Ca2+增加，而Ca2+參與調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)和功能，當(dāng)線粒體中Ca2+過載，將損傷線粒體膜，進(jìn)而損壞線粒體功能[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖組(84～112 mmol·L-1)與低濃度組(28～56 mmol·L-1)相比，精子中游離Ca2+水平顯著增加，而且Ca2+主要分布在線粒體鞘和部分精子頂體中。因此，冷凍稀釋液中添加高濃度葡萄糖可能通過破壞精子線粒體功能，降低有氧代謝能力，造成精子懸浮液中乳酸的大量積累。在大量乳酸的作用下，使精子周圍環(huán)境pH改變[24]，影響了精子的生存和活力。這一假設(shè)也在筆者進(jìn)一步的試驗(yàn)中得到證實(shí)，以含有適合濃度葡萄糖(56 mmol·L-1)的稀釋液為基礎(chǔ)液，添加不同含量的乳酸，發(fā)現(xiàn)冷凍-解凍的精子活力均顯著下降。

a1.DCFH-DA染色；b1.PI熒光染色；c1.a1和b1合并；a2.Fluo 3-AM染色；b2.PI熒光染色；c2.a2和b2合并。a1～c2 400×。C.DCFH-DA熒光信號(hào)的檢測；D.Fluo 3-AM熒光信號(hào)的檢測。上標(biāo)不同大寫字母表示不同濃度組間差異極顯著，P<0.01。下同a1. DCFH-DA fluorescent staining; b1. PI fluorescent staining; c1. a1 and b1 merge; a2. Fluo 3-AM fluorescent staining; b2. PI fluorescent staining; c2. a2 and b2 merge. a1-c2 400×. C. The DCFH-DA fluorescence intensity; D.The Fluo 3-AM fluorescence intensity. Different superscript A, B, C, D indicate the extremely significant difference among different concentration groups, P<0.01.The same as below圖3 DCFH-DA和Fluo 3-AM熒光染色及熒光強(qiáng)度分析Fig.3 DCFH-DA and Fluo 3-AM fluorescent staining and fluorescent intensity

Pr.總蛋白Pr.The total protein圖4 不同濃度葡萄糖處理后冷凍-解凍精子中ATP(A)和精子懸浮液中丙酮酸(PA)(B)和乳酸(LA)(C)濃度以及乳酸對(duì)精子冷凍保存的影響(D)Fig.4 The ATP in sperm, pyruvic acid (PA) and lactic acid (LA) in sperm suspension with different concentrations glucose treatment and effect of lactic acid with different concentrations on the motility of cryopreservated sperm

精子通過糖酵解和OXPHOS提供能量，維持精子的功能[25-26]，在此過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)。以及在精子冷凍-解凍過程中，由于環(huán)境的改變、抗氧化物酶的缺乏，破壞ROS產(chǎn)生/清除之間的平衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生[27]。精子中高水平的ROS會(huì)破壞核的結(jié)構(gòu)[28-30]，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。

本研究，添加葡萄糖能夠顯著提高ATP的產(chǎn)生，而且在一定劑量范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，精子細(xì)胞產(chǎn)生ATP量逐漸增加。但更高濃度的葡萄糖(112 mmol·L-1)卻減少了ATP的產(chǎn)生。另外，添加葡萄糖后，冷凍-解凍精子中ROS水平明顯升高，其中添加56 mmol·L-1葡萄糖后，ROS水平極顯著升高(P<0.01)，特別是在活精子細(xì)胞中檢測到高水平的ROS(圖3a1～c1)。這也表明適量葡萄糖可以增強(qiáng)精子線粒體的氧化磷酸化過程，在馬精子研究中也表明，精子細(xì)胞中ROS水平反映了精子線粒體活性的強(qiáng)度[31]。而且本研究，添加56 mmol·L-1葡萄糖后，雖然精子中的ROS水平顯著升高，但并沒有影響到精子細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的完整性。這可能是由于精清中含有一些抗氧化物酶，能夠消除部分活性氧，從而起到保護(hù)精子的作用[32]。因此在精液冷凍稀釋液中添加適量葡萄糖可以增強(qiáng)線粒體活性，提高精子的代謝能力和抗凍能力。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在絨山羊精液冷凍保存過程中，在精液稀釋液中添加一定濃度的葡萄糖能夠促進(jìn)絨山羊精子冷凍-解凍過程中的代謝，提高冷凍保存效果。但過高濃度的葡萄糖會(huì)抑制精子代謝，降低冷凍保存效果，這可能是由于大量乳酸積累導(dǎo)致的。