毛序棘豆內(nèi)生真菌分離鑒定及系統(tǒng)進化分析

孫 璐，任禎慧，宋潤杰，權(quán)海云，焦韻潔，黃竹濤，王敬龍，趙寶玉，路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.西藏農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，拉薩 850000)

棘豆屬植物在世界范圍內(nèi)大約有300種，主要分布在北半球的歐亞和北美等地[1]，我國有125種、4個變種和4個變型[2]，其中有近10種有毒植物[3]，主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏等西部草原[4]。動物采食棘豆屬有毒植物后表現(xiàn)有后肢拖地、搖擺，步態(tài)不穩(wěn)，四肢麻痹僵硬，頭頸部不斷做水平擺動等以運動機能障礙為特征的臨床癥狀，也可導(dǎo)致母畜不孕、流產(chǎn)，公畜不育，胎兒畸形，畜產(chǎn)品質(zhì)量下降，甚至家畜大量死亡，嚴重阻礙了畜牧業(yè)的健康發(fā)展[5-6]。

內(nèi)生真菌(fungal endophyte)是指在健康植物內(nèi)寄生、在各種組織器官內(nèi)部或者細胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌，包括菌根真菌和所有植物病原菌在內(nèi)的一個大類群[7]。1999年，Braun等[8]從瘋草中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌并初步認為瘋草產(chǎn)毒機制與其內(nèi)生真菌感染有關(guān)。隨后，Cook等[9]、Gao等[10]和Grum等[11]先后通過qPCR及LC-MS證明棘豆蠕孢菌(Undifilumoxytropis)是棘豆屬有毒植物主要毒性成分——苦馬豆素(swainsonine)生物合成的根本原因。研究表明，內(nèi)生真菌在棘豆屬有毒植物中分布廣泛，路浩等[12]從急彎棘豆中分離到鐮刀菌屬、裸胞殼菌屬和曲霉菌屬；陳基萍等[13]從黃花棘豆、蘭花棘豆、變異黃芪等中分離到毛殼菌屬、梭孢殼屬、足孢子菌屬等內(nèi)生真菌；而后周啟武等[14]從小花棘豆中分離到鏈格孢屬、鐮刀菌屬和埃里磚格孢屬；路浩等[15]從甘肅棘豆中分離到鏈格孢屬、附球菌屬、鐮刀菌屬等內(nèi)生真菌。

毛序棘豆(Oxytropistrichophora)屬于豆科棘豆屬的多年生灌木，根粗壯，莖短被白色硬毛，適應(yīng)性強，分布于塔什庫爾干西部邊境，高山帶石質(zhì)山坡[16]，在河北、北京、山西陽高縣、陜西延安和綏德及甘肅定西等地均有分布[17]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，動物一般不主動采食毛序棘豆，且它與其他有毒棘豆的外形相似，因此懷疑該植物屬于瘋草的一種。但目前有關(guān)毛序棘豆的研究較少，特別是尚未見有毛序棘豆內(nèi)生真菌種類與種群分布特點的報道，因此，本試

驗采用表面消毒法分離毛序棘豆內(nèi)生真菌，運用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析技術(shù)進行內(nèi)生真菌種屬鑒定，闡明毛序棘豆內(nèi)生真菌的種類及種群分布特點，研究結(jié)果可進一步豐富棘豆屬有毒植物內(nèi)生真菌多樣性，也為毛序棘豆內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 實驗所用毛序棘豆植物樣本于2016年5月采自甘肅省通渭縣，對剛采集的新鮮植物樣本作干燥處理后帶回實驗室保存?zhèn)溆?，該植物樣品包含根、莖、葉和種子。

1.1.2 主要儀器、設(shè)備與試劑 霉菌培養(yǎng)箱(中儀國科)、XP基因擴增儀(杭州博日)、TG16A臺式高速離心機(上海盧湘)、冰箱、光學(xué)顯微鏡(廈門麥克奧迪)、凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE)、無水乙醇、2%次氯酸鈉、2% CTAB分離緩沖液、氯仿、異戊醇、3 mol·L-1NaAc、真菌通用引物ITS1和ITS4、2×EsTaqMAsterMix(Dye)、1×TBE緩沖液、DNA Marker(2 000 bp)、核酸染料(StarGreen)、中性樹膠等。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g·L-1，20 g·L-1瓊脂粉，20 g·L-1葡萄糖。

1.2 毛序棘豆內(nèi)生真菌的分離

1.2.1 植物樣品的表面消毒 將毛序棘豆植物樣品的根、莖、葉、種子用去離子水洗去表面泥沙和塵土，用無菌鑷子將植物的根、莖、葉分離后用去離子水浸泡2～3 h，然后在無菌實驗操作臺對植物組織進行表面消毒。表面消毒的程序：75%酒精漂洗30 s；無菌水漂洗1 min；2%次氯酸鈉漂洗2 min；無菌水漂洗1 min，重復(fù)4次；由于次氯酸鈉消毒作用較強，因此將2%次氯酸鈉的消毒時間作適量調(diào)整，如表1所示。將最后一次清洗所得滅菌去離子水滴入PDA培養(yǎng)基的表面，做組織印記檢測，培養(yǎng)一周后觀察該培養(yǎng)基表面是否有其他微生物生長，以此驗證表面消毒效果。

表1植物組織表面消毒時間選擇

Table1Thesurfacedisinfectionscheduleofplanttissues

min

1.2.2 毛序棘豆內(nèi)生真菌的分離 將漂洗完的植物的根、莖、葉和種子用已高壓過的濾紙包裹，盡可能將水分吸干，然后用手術(shù)剪將根、莖剪成2～5 mm，葉剪成3 mm×3 mm的小塊，由于毛序棘豆的種子較小，將其剪開，留有創(chuàng)面即可，注意在剪不同植物組織時要用酒精棉球消毒，防止不同組織內(nèi)的真菌交叉，而后將已剪好的植物組織用無菌鑷子分別接種于PDA平板上，每個次氯酸鈉時間梯度接兩個PDA平板，接種時注意將切口接入培養(yǎng)基內(nèi)，然后放置于真菌恒溫培育箱內(nèi)，25 ℃培養(yǎng)一周后將具有明顯菌落差異的真菌挑取頂端菌絲重新接種到新的PDA平板上，重復(fù)該操作直至得到純化菌株，將其作分離率(isolation rate，IR)分析，來衡量毛序棘豆每個組織部位受內(nèi)生真菌浸染的程度，而后將純化菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)一段時間后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 毛序棘豆內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)真菌在PDA培養(yǎng)基上的生長狀況，將純化菌株接種在固體培養(yǎng)基上，每天固定時間記錄菌落的生長狀況，包括菌落顏色、形態(tài)、大小等，在菌落生長到一定階段，采用菌絲插片的方法制作菌絲玻片，用顯微鏡觀察菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、產(chǎn)孢子梗著生情況、孢子形態(tài)等微觀特征，將所觀察記錄的結(jié)果參考《真菌鑒定手冊》[18]對其進行初步種屬鑒定。

1.4 5.8S rDNA-ITS序列分析

1.4.1 內(nèi)生真菌基因組DNA的提取 采用改良CTAB法提取純化菌株DNA[19]：刮取菌絲置于研缽中，分兩次加液氮20 mL，快速研磨成粉末狀，稱取50 mg于1.5 mL的離心管內(nèi)，加入600 μL2% CTAB 緩沖液(65 ℃預(yù)熱)，振蕩混勻后置于65 ℃水浴鍋中45～60 min，期間顛倒混勻3次；加入600 μL混合液(氯仿∶異戊醇=24∶1，-20 ℃預(yù)冷)，室溫孵育3～5 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液于新的1.5 mL的離心管，重復(fù)三次；將最后一次離心所得上清液吸至2.0 mL的離心管內(nèi)，加60 μL 3 mol·L-1NaAc溶液(pH 6.0)和900 μL無水乙醇(-20 ℃預(yù)冷)輕輕顛倒混勻后，置于-20 ℃的冰箱中1 h以上或過夜；4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清液，75%的乙醇溶液(-20 ℃預(yù)冷)清洗沉淀3次，揮干乙醇；加入30～50 μL ddH2O溶解DNA，而后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 5.8S rDNA-ITS片段的擴增與核苷酸序列的測定 5.8S rDNA-ITS片段擴增采用50 μL的PCR體系，該反應(yīng)體系：真菌通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各2 μL，DNA模板3 μL，2×EsTaqMaster Mix 23 μL，ddH2O 20 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min，4 ℃保溫10 min。

將PCR產(chǎn)物用移液槍吸取6 μL點樣，并吸取同樣體積的DNA marker(2 000 bp)，倒入電泳液(1×TAE緩沖液)至剛剛沒過電泳膠，連接電泳儀正負極開通電源，電泳條件：電壓90 V、電流500 A、40 min；電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。若觀察到明顯的電泳條帶，則將PCR產(chǎn)物吸取20 μL至0.5 mL離心管中，標記后送往測序公司進行檢測。

1.4.3 毛序棘豆內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進化分析 將測序結(jié)果序列與NCBI的DNA數(shù)據(jù)庫進行比對，選出比對結(jié)果中相似度較高并且種屬關(guān)系較近的序列，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定菌株種屬，將所得菌株種屬作相對分離頻率(relative frequency，RF)分析，來衡量某個屬的內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度；然后將測序結(jié)果導(dǎo)入到MEGA 5.05軟件中采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]，自展次數(shù)為1 000次，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹判斷其親緣關(guān)系，并進行系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié) 果

2.1 毛序棘豆內(nèi)生真菌的分離

在對毛序棘豆植物組織進行表面消毒時，將2%次氯酸鈉消毒時間作以梯度，接種后觀察發(fā)現(xiàn)，1和 1.5 min消毒時間下的印記對照平板均被除內(nèi)生真菌外的其他微生物污染，且在1 min 45 s和2 min 消毒時間下分離所得的內(nèi)生真菌種類最多，因此次氯酸鈉的消毒時間選定為2 min，將在此消毒時間分離并純化所得菌株，根據(jù)其形態(tài)合并為29株，將所得數(shù)據(jù)作分離率分析，可知莖的分離率最高，根和葉次之，而種子中未分離出(表2)。

2.2 毛序棘豆內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)純化后的菌株，在培養(yǎng)過程中記錄菌落及菌絲的主要特征，結(jié)果如表3所示。

2.3 毛序棘豆內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

將PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果在NCBI上比對，比對結(jié)果如表4所示，相似度都高達96%以上，得到分屬于4綱，5目，6科，10屬，共29種內(nèi)生真菌，其中有6種未命名，Paraphomasp.(P1235)未見相對應(yīng)的中文屬名(表4)，從毛序棘豆不同組織內(nèi)生真菌的菌屬相對分離頻率(表5)來看，毛序棘豆內(nèi)生真菌總相對分離頻率為79.31%，其中莖的內(nèi)生真菌相對分離頻率最高，為48.28%，根和葉次之分別為31.03%和20.69%，就分離到的菌屬而言，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)分別以17.24%和13.79%的相對分離頻率成為根和葉的優(yōu)勢菌屬；鏈格孢菌屬(Alternariasp.)以27.59%的相對分離頻率成為莖的優(yōu)勢菌屬；木霉菌屬(Trichodermasp.)的Trichodermaviride(wxm58)廣泛存在于根、莖、葉三種組織，部分優(yōu)勢菌屬的菌落和菌絲形態(tài)如圖1所示。

表2毛序棘豆內(nèi)生真菌分離結(jié)果

Table2IsolationresultsofendophyticfungifromOxytropistrichophora

組織部分Tissues2%NaClO滅菌時間/minSterilization time組織塊數(shù)Tissues number菌落總數(shù)Colony number分離率/%Isolation rate葉Leaf254611.11莖Stem2461839.13根Root2461123.91種子Seed25400

表3毛序棘豆內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征

Table3MorphologicalcharacteristicsofendophyticfungiformOxytropistrichophora

菌株編號Strains No.分離部位Tissues菌落特征Colony characteristics菌絲特征Hyphae characteristics生長速度/(mm·d-1)Growth rateY3葉Leaf菌絲氣生生長,菌落白色,質(zhì)密,隆起呈丘狀,形狀不規(guī)則,絮狀邊緣,背面中間為黑色,邊緣無色菌絲彎曲,有橫隔,分支,頂端鈍圓2.5G1根Root菌絲氣生生長,菌落同心圓狀,中間橘黃色,四周玫紅色,疏松,圓形,中心凸起,纖毛狀邊緣,背面中間為黃色,四周為橘紅色菌絲玫紅色,有橫隔,分支7.5G2根Root菌絲氣生生長,粗壯,菌落土黃色,疏松,形狀不規(guī)則,表面有水滴,背面無色菌絲透明,無橫隔9.5G6根Root菌絲匍匐生長,菌落深灰色,疏松,扁平,全圓,纖毛狀邊緣,背面為灰色菌絲彎曲,暗棕色,有橫隔,分支3.0

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

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表4毛序棘豆內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

Table4IdentificationresultsofendophyticfungifromOxytropistrichophora

菌株編號Strains No.屬Genus種SpeciesY3殼多隔孢屬(Stagonospora)Stagonosporopsis astragali (AS1S2-1)G1鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(WBS014) G2毛霉屬(Mucor)Mucor hiemalis(WBS012) G6殼多隔孢屬(Stagonospora)Stagonosporopsis cucurbitacearum(JH3J1-4)G7未定屬Fungal sp.(YWZKDF2-1) G8漆斑菌屬(Myrothecium)Myrothecium verrucaria(E21) G10-Paraphoma sp.(P1235) GY1鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(WBS031)GY2鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(QL1-1)GY3鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium tricinctum(Z5)GY4鐮刀菌屬(Fusarium)Fusarium lateritium(MAFF 235344) J1小雙胞腔菌屬(Didymella)Didymellaceae sp.(sib5-1-2)J2莖點霉屬(Phoma)Phoma fungicola (H11_H10_1104035152Q)J5莖點霉屬(Phoma)Phoma medicaginis(1-00219-2)

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

A. GJY4的菌落；B. GJY4的菌絲10×100；C. JVI的菌落；D. JVI的菌絲10×100；E. J17的菌落；F. J17的菌絲10×100；G. G1的菌落；H.G1的菌絲10×100A. The colony of GJY4; B. The hyphae of GJY4, 10×100; C. The colony of JVI; D. The hyphae of JVI, 10×100; E. The colony of J17; F. The hyphae of J17, 10×100; G. The colony of G1; H. The hyphae of G1, 10×100圖1 毛序棘豆內(nèi)生真菌菌落及菌絲形態(tài)Fig.1 Morphology of colonies and hyphae of endophytic fungi from Oxytropis trichophora

將所得菌株采用MEGA軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，由親緣關(guān)系的遠近可以將除去族外菌株Mucorhiemalis(WBS012)的其余菌株分為種群Ⅰ和種群Ⅱ，自檢支持率分別為89%和99%；根據(jù)親緣關(guān)系遠近，種群Ⅰ又可分為種群A和種群B，且自檢支持率均為99%。種群Ⅱ又可進一步分為種群C和種群D，自檢支持率分別為93%和92%，種群A可分為兩個種群，自檢支持率分別為60%和62%，種群B內(nèi)有自檢支持率分別為96%、92%的兩個種群，而種群C和種群D則無下屬的分支。

圖2 基于5.8S rDNA-ITS序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on 5.8S rDNA-ITS sequences

3 討 論

采用表面消毒法將植物組織樣本進行消毒，而消毒劑消毒時，通常是由表面緩慢往里滲透的，因此作用時間越長，植物內(nèi)生真菌被殺滅的可能性越大，被分離出的越少，但是，作用時間太短又不足以殺滅組織表面的微生物，達不到滅菌的效果，因此需要找出植物組織的最佳消毒時間，由于本試驗中2%次氯酸鈉的消毒作用較強，因此僅將其作用時間作濃度梯度，而后觀察到2 min為根、莖、葉的最佳消毒時間。路浩等[12]在急彎棘豆內(nèi)生真菌的分離鑒定中觀察到根、莖、葉、花和種子的最佳消毒時間也是2 min；而曹丹丹等[21-22]在分離變異黃芪和莖直黃芪植株中的內(nèi)生真菌時發(fā)現(xiàn)莖的最佳消毒時間分別為2和3 min，葉和花的最佳消毒時間為3 min；表明同屬植物的最佳表面消毒時間有相同的可能，而不同屬植物的消毒時間有差異。另外，在培養(yǎng)過程中還發(fā)現(xiàn)菌落的生長速率一般在6 d以后有明顯或不明顯的下降，可見這些菌株的生長周期較短，為快生型菌類。由表2可以看出，莖的分離率最高，為39.13%；根次之，為23.91%；葉為11.11%；而種子中未分離到內(nèi)生真菌，可能毛序棘豆內(nèi)生真菌的傳播方式為水平傳播。此外，路浩等[12]發(fā)現(xiàn)急彎棘豆植物樣本中，莖和葉中分離到的內(nèi)生真菌最多，根、花和種子分離到的較少。周啟武等[14]發(fā)現(xiàn)小花棘豆植株中葉的內(nèi)生真菌分離率為56.82%，為最高；種子的分離率為42.37%，次之；莖和葉柄的內(nèi)生真菌分離率在30.00%左右，為最少。隨后，路浩等[15]發(fā)現(xiàn)甘肅棘豆植株中莖內(nèi)生真菌的分離率(83.03%)高于葉(57.67%)；曹丹丹等[21-22]發(fā)現(xiàn)變異黃芪植株中葉的內(nèi)生真菌分離率最高，為100.00%；花次之，為45.00%；而莖直黃芪根、莖的內(nèi)生真菌分離率均在80.00%左右。由此可見，內(nèi)生真菌侵染有毒植物的組織部位較為廣泛。

將所得的毛序棘豆內(nèi)生真菌鑒定后的結(jié)果進行分析后，可知(表5)莖的相對分離頻率最高，根和葉次之，且遠低于莖的相對分離頻率，就分離到的菌屬而言，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)分別以17.24%和13.79%的相對分離頻率成為根和葉的優(yōu)勢菌屬，鏈格孢菌屬(Alternariasp.)以27.59%的分離率成為莖的優(yōu)勢菌屬，而木霉菌屬(Trichodermasp.)在毛序棘豆植物組織內(nèi)的分布最為廣泛，在根、莖、葉中均有分布；路浩等[12]發(fā)現(xiàn)在急彎棘豆植株中，分離到鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、裸胞殼菌屬(Emericellasp.)、曲霉菌屬(Aspergillussp.)的內(nèi)生真菌；周啟明等[14]發(fā)現(xiàn)小花棘豆中的優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、埃里磚格孢屬(Embellisiasp.)和Undifilumsp.；路浩等[15]發(fā)現(xiàn)甘肅棘豆中的優(yōu)勢菌屬為Undifilumsp.，曹丹丹等[21-22]發(fā)現(xiàn)變異黃芪中優(yōu)勢菌屬為炭角菌屬和Undifilumsp.，莖直黃芪中的優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬(Alternariasp.)和Undifilumsp.，而這五種有毒植物中都分離到鐮刀菌屬(Fusariumsp.)的內(nèi)生真菌[12,14-15,21-22]，由于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)下屬的菌株種類繁多，且一般可通過土壤侵入植物組織，而且鐮刀菌能夠在土壤中營腐生生活，所以根和土壤中的莖一般較易感染，因此，這也是其分布廣泛的原因之一，另外鐮刀菌屬的變異性較大，有出現(xiàn)高致病性菌株的可能，且危害嚴重[23]；小花棘豆、甘肅棘豆和莖直黃芪中均分離到鏈格孢菌屬(Alternariasp.)的內(nèi)生真菌[21-22]，鏈格孢菌屬(Alternariasp.)分布廣泛，種類多樣，變異性較大，不但能夠感染植物，給農(nóng)林業(yè)造成經(jīng)濟損失，而且其中有些種類甚至可以感染人或動物，危害人畜健康[24]。

4 結(jié) 論

通過對毛序棘豆各組織內(nèi)生真菌的分離與鑒定，共獲得10屬29種內(nèi)生真菌；在毛序棘豆各組織中，內(nèi)生真菌對莖的侵染頻率最高，根次之，葉最少；鏈格孢菌屬(Alternariasp.)是毛序棘豆植株莖中的優(yōu)勢菌屬，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)是毛序棘豆植株根和葉中的優(yōu)勢菌屬。