高通量測序分析Nisin對腹瀉小鼠腸道菌群的影響

賀美玲，王純潔，賈知鋒，斯木吉德，敖日格樂*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

腸道菌群與人類的疾病有著緊密的聯(lián)系，通過攝入適量益生菌可在一定程度上改善腸道微生物結(jié)構(gòu)[1]。人體腸道中定植的菌群數(shù)量是人體基因總數(shù)的150倍左右。當腸黏膜微生物屏障被破壞時，大量的致病菌定植于腸道中，從而引起炎癥[2]。腹瀉病是由致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichiacoli)所引起的人畜共患疾病之一[3]。目前，治療由致病性E.coli所引起的腹瀉病主要采用抗生素進行治療，但是抗生素的濫用會導(dǎo)致諸多問題(如耐藥性等)，也會導(dǎo)致動物免疫力降低[4]。通過攝入益生菌可平衡動物腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，使腸道內(nèi)產(chǎn)生活性物質(zhì)以及有益的活性微生物，動物及人腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌及擬桿菌可作為人和動物腸道內(nèi)生理指示菌[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群結(jié)構(gòu)與多種疾病存在一定的關(guān)系，腸道菌群的紊亂可引起多種疾病的發(fā)生[6]。

據(jù)報道，腸道是人類及動物的主要消化、吸收的場所，腸道中存在大量的細菌[7-8]。Nisin具有抑菌作用，其機制是Nisin通過不同的結(jié)構(gòu)域嵌入到細胞膜中，阻止細胞壁生物合成[9]。據(jù)研究，乳酸鏈球菌屬于益生菌，可改善小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)[10]，有效治療炎癥性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎和腹瀉等[11-12]。因此，研究乳酸菌代謝產(chǎn)物具有一定的價值。

酸馬奶是蒙古族傳統(tǒng)的發(fā)酵馬奶[13]，其含有豐富的益生菌(如乳酸乳桿菌等)[14]。Nisin是乳酸乳桿菌的一種獨特的代謝產(chǎn)物，具有抗菌作用[15]。本試驗通過致病性E.coliO1構(gòu)建小鼠腹瀉病模型，對腹瀉小鼠灌胃Nisin，通過高通量技術(shù)對小鼠盲腸微生物進行分析，以研究Nisin對腹瀉小鼠盲腸微生物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g(內(nèi)蒙醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。

1.1.2 試驗材料 乳酸鏈球菌素(Nisin)，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牛生產(chǎn)學(xué)實驗室提取保存[16]；抗生素：氨芐青霉素(ampicillin)，購自葵花藥業(yè)集團湖北武當有限公司；鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)，購自吉林省百年六福堂藥業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱(JC-SPJ-480)，濟南精誠實驗儀器有限公司；凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子分析天平(CP224C)，上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Nisin對感染致病性E.coliO1小鼠體內(nèi)抗菌保護率的測定 為改善細菌性腹瀉病的發(fā)生，選擇5～6周齡70只鼠(雌雄各半)隨機分成7個組，空白對照組灌胃滅菌生理鹽水(表1)。各試驗組連續(xù)灌胃5 d，2次·d-1(上午8:00，下午16:00)，每次0.3 mL，除空白對照組外，各組在第5天末次給藥1 h 后，腹腔注射0.3 mL 80% MLD的E.coliO1(2.50×1011CFU·mL-1)，試驗結(jié)束時，觀察并記錄各組感染后48 h 內(nèi)的死亡數(shù)量，計算其保護率[17]。

保護率=(陰性對照組死亡數(shù)-藥物組死亡數(shù))/陰性對照組死亡數(shù)×100%[17]。

表1Nisin對感染致病性E.coliO1小鼠的保護率分組情況及給藥方案

Table1GroupinganddosageregimentofthetestaboutNisin’sprotectionratstomiceinfectedwithpathogenicE.coliO1

組別 group小鼠/只 Mice給藥方案 Administration regiment空白對照組 Blank control group10注射生理鹽水,灌服滅菌生理鹽水陰性對照組Negative control group10灌服滅菌生理鹽水,先給藥5 d,注菌,再給藥2 d,2次·d-1,0.3 mL·次-1環(huán)丙沙星組Ciprofloxacin group10灌服環(huán)丙沙星0.13 g·mL-1,同上注菌氨芐青霉素組Ampicillin group10灌服氨芐青霉素0.001 g·mL-1,同上注菌Nisin低劑量組Nisin low dose group10灌服Nisin 0.001 g·mL-1,同上注菌Nisin中劑量組Nisin medium dose group10灌服Nisin 0.002 g·mL-1,同上注菌Nisin高劑量組Nisin high dose group10灌服Nisin 0.003 g·mL-1,同上注菌

以上藥物每次配合蒸餾水灌服，單只動物單次所用藥量需用0.3 mL蒸餾水配合灌服。下表同

The above drugs are drenched to mice with distilled water each time, single dose of single animal need to use 0.3 mL of distilled water with gavage. The same as below

1.3.2 Nisin對感染致病性E.coliO1小鼠腸微生物屏障的影響 從保護率篩選情況可知，篩選出最佳劑量的藥物組見表1。從50只SPF小鼠(雌雄各半)中隨機抽取10只作為空白對照組灌胃生理鹽水，其余小鼠腹腔注射E.coliO1懸液0.2 mL·只-1(0.5×109CFU·mL-1)建模，陰性對照組結(jié)束時(注菌48 h后)，對存活小鼠進行樣品采集，見表2。

表2Nisin對小鼠腸道菌群的影響試驗分組情況及給藥方案

Table2GroupofdosageregimentofthetestaboutNisin’seffectonintestiualmicroflorainmice

組別 Group小鼠/只 Mice給藥方案 Administration regiment空白對照組 Blank control group10不造模,灌服滅菌生理鹽水陰性對照組 Negative control group10先灌服滅菌生理鹽水5 d,注菌造模,再連續(xù)灌胃10 d,先給藥5 d再注菌,然后連續(xù)給藥10 d,2次·d-1,每次0.3 mL·只-1環(huán)丙沙星組Ciprofloxacin group10灌服環(huán)丙沙星0.13 g·mL-1, 同上氨芐青霉素組Ampicillin group10造模,灌服氨芐青霉素0.001 g·mL-1,同上乳酸鏈球菌素組 Nisin group10造模,灌服0.002 g·mL-1,同上

1.3.3 Nisin對外周血淋巴細胞及其亞群的影響 對每組5只小鼠的眼眶取血置于肝素鈉采血管中，取200 μL 抗凝血，加10倍稀釋的溶血素2 mL，搖勻、離心及PBS洗滌3次，留沉淀，加150 μL PBS 稀釋，調(diào)細胞濃度為 1×106·μL-1；每份50 μL，分成3份，加入上樣管分別加10 μL小鼠淋巴細胞熒光標記抗體 CD3-R-PE/CD19-FITC、CD4-PE/CD8-FITC，4 ℃冰箱避光標記 30 min，加 2 mL PBS，1 500 g 離心7 min, 棄上清; 沉淀中加200 μL PBS，懸浮振蕩，流式細胞儀分別計數(shù)10 000 個細胞，圈門淋巴細胞，檢測 CD3+T、CD4+T、CD8+T 和CD19+B 細胞所占百分數(shù)。

1.3.4 盲腸糞樣菌落計數(shù)[20]第15天灌藥后2 h 內(nèi)在無菌操作臺中取出盲腸，將各組盲腸內(nèi)容物分別用無菌生理鹽水稀釋(1∶10)，即為原液的101～108倍，分別取50 μL涂布于選擇性培養(yǎng)基[雙歧桿菌培養(yǎng)基(BBL)、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、乳酸菌培養(yǎng)基(MRS)、腸球菌選擇性培養(yǎng)基(EF)]置于不同條件的培養(yǎng)箱中，分別檢測雙歧桿菌、E.coli、乳酸桿菌、腸球菌數(shù)量(每種菌設(shè)三個重復(fù))。菌落計算公式為：菌落數(shù)量(lg CFU·g-1)=lg[X/0.5×稀釋倍數(shù)/盲腸內(nèi)容物質(zhì)量(g)]，同稀釋度平均菌落數(shù)為X，菌群數(shù)量用lg CFU·g-1(盲腸內(nèi)容物)表示[18]。給藥方案同表2。

1.3.5 Nisin對盲腸微生物的影響 第15天灌藥后2 h內(nèi)在無菌操作臺上收集各組小鼠盲腸糞便0.5 g置于無菌無酶EP管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。利用PCR對每組4只小鼠盲腸內(nèi)容物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) 16S RNA V3～V4區(qū)進行擴增。對擴增產(chǎn)物用干冰保存送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司針對樣品進行PCR測序。詳細步驟見參考文獻[21-22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用Excel軟件對測定數(shù)據(jù)進行處理；并用SAS 9.0統(tǒng)計軟件ANOVA對數(shù)據(jù)進行方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 Nisin對感染致病性E. coli O1小鼠的體內(nèi)抗菌保護率

Nisin對感染致病性E.coliO1小鼠的保護率見表3。Nisin中劑量組對感染致病性E.coliO1小鼠的保護率高于Nisin低劑量組為37.50%，環(huán)丙沙星和氨芐青霉素組保護率為50%，Nisin組保護率低于環(huán)丙沙星組，但是這種益生菌的代謝產(chǎn)物的耐藥性極低，且副作用極小[18]。

2.2 E. coli O1對小鼠十二指腸的影響

十二指腸在腹瀉期間的作用可能更明顯[23]。模型組中小鼠出現(xiàn)腹瀉、被毛蓬松、行動遲緩等癥狀，說明造模成功。模型組中十二指腸出現(xiàn)腫脹，短絨和絨毛脫落。對照組中十二指腸絨毛排列整齊緊密，上皮細胞無脫落，黏膜完整(圖1)。

表3Nisin對感染致病性E.coliO1小鼠的保護率

Table3ProtectionrateofNisintomiceinfectedwithpathogenicE.coliO1

組別Groups動物數(shù)/只Animals存活數(shù)/只Survival保護率/%Protection rate空白對照組 Blank control group1010100陰性對照組Negative control group1020鹽酸環(huán)丙沙星組Ciprofloxacin group10650氨芐青霉素組Ampicillin group10650Nisin低劑量組Low dose of Nisin10425Nisin中劑量組Middle dose of Nisin10537.5Nisin高劑量組High dose of Nisin10425

圖1 大腸桿菌對腹瀉小鼠十二指腸的影響Fig.1 Effects of E. coli O1 on the duodenum of mice with diarrhea

2.3 Nisin對外周血淋巴細胞及其亞群的影響

由表4可知，縱向看，乳酸鏈球菌素(Nisin)組中CD4+T、CD8+T、CD3+T及CD19+B細胞百分比顯著高于空白對照組、環(huán)丙沙星組及氨芐青霉素組(P<0.05)；陰性對照組中CD4+T、CD8+T、CD3+T及CD19+B細胞百分比均顯著降低(P<0.05)。Nisin組中CD4+T/CD8+T細胞比值均小于其他各組。

%

大寫字母不同表示同列組間差異顯著(P<0.05)

Different capital letters means significant difference within the same column (P<0.05)

2.4 Nisin對腹瀉小鼠盲腸微生物活菌數(shù)的影響

Nisin對小鼠盲腸微生物的影響，Nisin組、環(huán)丙沙星組以及氨芐青霉素組中大腸桿菌的數(shù)量顯著低于陰性對照組(P<0.05)，尤其以Nisin組效果最佳。Nisin組中乳酸桿菌的數(shù)量顯著高于陰性對照組、環(huán)丙沙星組以及氨芐青霉素組(P<0.05)，并且環(huán)丙沙星組中雙歧桿菌的數(shù)量顯著低于陰性對照組(P<0.05)，環(huán)丙沙星組和氨芐青霉素組均顯著低于Nisin組(P<0.05)(表5)。

lg CFU·g-1

小寫字母不同表示同列間差異顯著(P<0.05)。下表同

The difference in lowercase letters indicates significant difference between the same columns (P<0.05). The same as below

2.5 Nisin對腹瀉小鼠盲腸微生物菌群多樣性的影響

利用Mothur軟件對每組樣品的OTU數(shù)量進行計算，并且代表了組間樣品的豐度[24](表6)。在所有樣品中，OTU數(shù)量最多的為空白對照組(1 652.75) 和Nisin組(1 507.75)，最小值為氨芐青霉素組(930.00)，說明Nisin組和空白組中菌群豐度很高，并且各組樣品存在差異。組間樣品中菌群多樣性指數(shù)為Nisin組(ACE=1 417.25，Chao1=1 378.45，Shannon=7.56)顯著高于陰性對照組(ACE=969.54，Chao1=340.29，Shannon=6.63)。同時，Alpha多樣性分析也表明，給小鼠注菌后，其Nisin組中腸道菌群的多樣性高于陰性對照組，各組之間存在差異顯著(P<0.05)。Shannon的值越大，生物多樣越高，Nisin組為7.56，其余各組均在6.47～7.13之間，說明Nisin組對腹瀉小鼠盲腸微生物的多樣性越高。Nisin組中Simpson值顯著低于除環(huán)丙沙星組外的其他各組(Simpson值越低表明菌落多樣性越高)。各組之間Coverage的值均在0.97以上，因此，樣品中序列未被檢測到的可能性極低。

表6各組樣品糞便菌群的OTU數(shù)量及Alpha多樣性

Table6OTUnumberandAlphadiversityoffecalmicroflorainallgroups

組別GroupOTUACEChao1ShannonSimpsonCoverage空白對照組Blank control1 652.75a1 950.47a1 905.61a7.13a0.008 1b0.970 7陰性對照組Control1 227.75c969.54e340.29e6.63b0.017 4a0.971 1環(huán)丙沙星組Ciprofloxacin1 275.50c1 571.13b1 536.16b6.91b0.001 9e0.977 3氨芐青霉素組Ampicillin930.00d1 117.71d1 087.81d6.47b0.005 7c0.974 4Nisin組 Nisin 1 507.75b1 417.25c1 378.45c7.56a0.003 3d0.975 0

2.6 主坐標分析(PCoA)

主坐標分析反應(yīng)各樣本中菌群構(gòu)成的相似性(圖2)。基于Weighted Unifrac距離和 Unweighted Unifrac 距離來進行PCoA分析，并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖展示。如果樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。本試驗中，Nisin組(NIG)、空白對照組(BCG)、陰性對照組(NCG)、鹽酸環(huán)丙沙星組(CIPG)、氨芐青霉素組(AMPG)幾乎聚在一起。

2.7 Nisin對腹瀉小鼠盲腸微生物菌群構(gòu)成的影響

5組樣品的菌群組成在門(phylum)水平上最大豐度排名前10的物種水平見表7，圖3。以Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁桿菌門)和Verrucomicrobia(疣微菌門)3個菌門為主，所占比例90.75%以上。其中Nisin 組中Bacteroidetes(擬桿菌門)所占比例顯著低于空白對照組(BCG)、陰性對照組(NCG)、鹽酸環(huán)丙沙星組(CIPG)、氨芐青霉素組(AMPG)。Nisin組(NIG)中厚壁桿菌門(Firmicutes)所占比例顯著高于空白對照組(BCG)、陰性對照組(NCG)、鹽酸環(huán)丙沙星組(CIPG)及氨芐青霉素組(AMPG)。Nisin組(NIG)中Verrucomicrobia(疣微菌門)所占比例顯著高于空白對照組(BCG)及氨芐青霉素組(AMPG)，高于陰性對照組(NCG)。Nisin組(NIG)中Cyanobacteria(藍藻門)所占比例顯著高于空白對照組(BCG)、陰性對照組(NCG)及氨芐青霉素組(AMPG)。綜上所訴，Nisin的攝入，有利于增加Firmicutes(厚壁桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)和Cyanobacteria(藍藻門)的數(shù)量，從而使腸道菌群的紊亂得到改善。

圖2 各組樣品Unweighted Unifrac 距離PCoA分析Fig.2 Unweighted Unifrac distance PCoA analysis for each group of samples

表7Nisin對微生物門水平上的影響

Table 7 Effects of Nisin on phylum levels%

大寫字母不同表示同行間差異顯著(P<0.05)。下同

Different capital letters indicate significant differences among peers (P<0.05). The same as below

圖3 各組樣品在門水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of each samples at phylum level

由表8和圖4可知，5組樣品的菌群組成在屬(genus)水平上豐度值：Nisin組(NIG)中Candidatus(變形桿菌綱)、Clostridium(梭狀芽胞桿菌)、Akkermansia屬和Lactobacillus(乳桿菌屬)所占的比例分別為8.51%、8.03%、4.73%和4.09%。氨芐青霉素組(AMPG)中Bacteroides(擬桿菌屬)和Lachnospiraceae(毛螺旋菌屬)所占比例分別為10.27%和9.76%?？v向看：Nisin組可顯著提升Candidatus(變形桿菌綱)、Clostridium(梭狀芽胞桿菌)的比例；氨芐青霉素組(AMPG)可顯著增加Bacteroides(擬桿菌屬)和Lachnospiraceae(毛螺旋菌屬)的比例。

表8Nisin對微生物屬水平上的影響

Table 8 Effects of Nisin on microbial genus levels%

圖4 各組樣品在屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of each samples at the level of genus

3 討 論

T細胞在成熟后分化出CD3抗原，隨后轉(zhuǎn)移至外周淋巴組織，它與特異性抗原或細胞相互接觸時，發(fā)揮免疫功能，在機體的細胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)中均具有重要作用[25]。據(jù)報道，乳酸鏈球菌素(Nisin)對呼吸系統(tǒng)的治療具有顯著的作用，可防止病原微生物感染的腹腔疾病[26]。本試驗中，Nisin可顯著增加CD4+T、CD8+T、CD3+T及CD19+B細胞百分比以及CD4+T/CD8+T的比值。Nisin是一種穩(wěn)定性好、毒副作用小的抗菌肽，人或家畜食用后在消化道內(nèi)可快速被蛋白水解酶消化成氨基酸[27]。根據(jù)口服給藥藥物特定傳輸這一特點，一些學(xué)者通過口服給予雙歧桿菌三聯(lián)活菌，進入腸道后，在腸道定植形成一道腸道菌群屏障來抵御外來病原菌及病毒的入侵[28-29]。研究表明，Nisin處理后可對大腸桿菌等具有顯著的抑菌作用[30]。Stevens等[31]證明了Nisin對細菌的抑制作用主要是破壞其細胞壁的通透性。同時，通過攝入一定量的Nisin可以改善腹瀉小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)以及增加單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度[18]。通常，E.coli進入動物機體后，使腸道菌群失調(diào)，通過破壞腸黏膜屏障功能而引起疾病(如腹瀉等)[32]。腸道內(nèi)致病菌(如大腸桿菌和腸球菌等)和益生菌(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)數(shù)量的變化是腸道健康的重要指標[18]。體內(nèi)試驗表明，使用Nisin具有顯著減少大腸桿菌的數(shù)量，顯著增加乳酸桿菌數(shù)量的作用，這種趨勢與文獻[18]相符。Bacteroidetes(擬桿菌門)和Firmicutes(厚壁桿菌門)成為小鼠腸道優(yōu)勢菌群，這一結(jié)果與相關(guān)研究報道的優(yōu)勢菌群結(jié)果相似[33]。腹瀉小鼠腸道微生物結(jié)果表明，Nisin組使ACE、Chao1、Shannon顯著增加，而陰性對照組中ACE、Chao1、Shannon均顯著降低，說明E.coliO1可破壞小鼠腸道微生物的動態(tài)平衡，使小鼠腸道微生物多樣性顯著降低，這一結(jié)果與參考文獻相似[34]。

在門水平上，Nisin組中小鼠盲腸微生物Bacteroidetes(擬桿菌門)最低，接近空白對照組。Nisin組中Firmicutes(厚壁桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)和Cyanobacteria(藍藻門)所占比例最高且高于其他各組。Firmicutes(厚壁桿菌門)是維持腸道健康的主要益生菌，在腸道中可以加快多糖發(fā)酵[35]。陰性對照組和氨芐青霉素組中Firmicutes(厚壁桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)和Cyanobacteria(藍藻門)最低，Bacteroidetes(擬桿菌門)最高。據(jù)報道，Bacteroidetes(擬桿菌門)數(shù)量增多可增加患敗血病和闌尾炎的風險，是腸道中主要的致病菌，這類細菌可以導(dǎo)致腹瀉病的發(fā)生[35]。在屬水平上，Nisin組中Candidatus(變形桿菌綱)、Clostridium(梭狀芽胞桿菌)、Akkermansia屬和Lactobacillus(乳桿菌屬)所占比例較高。陰性對照組中Akkermansia屬、Candidatus(變形桿菌綱)和Clostridium(梭狀芽胞桿菌)所占比例顯著低于Nisin組，很可能是因為E.coli打破了機體菌群平衡所引起的腹瀉病。

4 結(jié) 論

Nisin可顯著增加小鼠盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量，顯著減少大腸桿菌數(shù)量；同時增加OTU聚類豐度和淋巴細胞百分比，對提高厚壁桿菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍藻門(Cyanobacteria)以及乳桿菌屬(Lactobacillus)的數(shù)量效果顯著?？梢?，Nisin對增加以上菌屬具有一定的作用。