影響斑點(diǎn)叉尾 病毒病發(fā)病因素的探索

劉洪巖，王江，張世勇，王明華，趙彥華，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

斑點(diǎn)叉尾 病毒（Channel catfish virus,CCV），屬于皰疹病毒科（Herpesvirus）， 魚(yú)皰疹病毒屬（Ictalurivirus）[1]。CCV 是一種線性雙鏈 DNA 病毒[2]，病毒顆粒為20面體對(duì)稱，核衣殼由162個(gè)殼粒組成，直徑約為100nm，具有囊膜的完整病毒粒子，直徑約為175～200 nm[3]。CCV基因組全長(zhǎng)為134.2 Kb，共有79個(gè)開(kāi)放閱讀框。CCV通過(guò)滾環(huán)方式復(fù)制，可發(fā)生在10-35℃溫度范圍內(nèi)，35℃時(shí)復(fù)制速度最快，而30℃時(shí)復(fù)制量最大，最適的復(fù)制溫度是25-33℃。CCV能夠在25℃的池水中生存2 d，在池底淤泥中迅速失活[4]。

斑點(diǎn)叉尾 病毒傳播速度快、病程短、病死率高，給斑點(diǎn)叉尾 產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在已知的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，CCV的產(chǎn)生和傳播和外部環(huán)境有很大的關(guān)系，但并沒(méi)有確定各種影響因子對(duì)發(fā)病的具體影響力。因此，在目前的預(yù)防和治療措施中，沒(méi)有提出有效的解決預(yù)防方案，只能通過(guò)有效的管理來(lái)將影響降低。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)斑點(diǎn)叉尾 攻毒CCV，觀察不同的溫度、病毒量以及種質(zhì)對(duì)發(fā)病以及病死率的影響，旨在為CCVD的防控和斑點(diǎn)叉尾 抗病品種的選育提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2017年12月從江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地6—7月繁育的49個(gè)斑點(diǎn)叉尾 家系中隨機(jī)挑選體質(zhì)量為15.0～20.0 g的健康幼魚(yú)于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間每天投喂兩次，使用嘉吉精養(yǎng)魚(yú)料進(jìn)行投喂，正式試驗(yàn)開(kāi)始后停止喂食。使用加熱棒將水溫控制在28～30℃。

1.2 試驗(yàn)藥物

試驗(yàn)用的CCV來(lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，試驗(yàn)病毒先配置母液，梯度稀釋為103，104，105 TCID50。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)全程在室內(nèi)進(jìn)行，使用容量為250 L的塑料箱進(jìn)行養(yǎng)殖，試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)曝氣處理的自來(lái)水，pH 值7.8～8.2，溶解氧濃度＞5 mg/L，光照 200～1 200 lx，24 h曝氣。選擇100 g左右，大小均勻的斑點(diǎn)叉尾 進(jìn)行試驗(yàn)，每組10條。采用腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒，注射病毒體積為100 μL。

病毒濃度影響實(shí)驗(yàn)中，設(shè)103 TCLD、104 TCLD、105 TCLD 3個(gè)濃度組，每組3個(gè)平行。溫度影響試驗(yàn)中設(shè)置兩個(gè)溫度，分別為10℃和18℃，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。種質(zhì)影響試驗(yàn)中，設(shè)置兩種種質(zhì)，分別為正常的斑點(diǎn)叉尾 和白化的斑點(diǎn)叉尾，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。溫度影響試驗(yàn)中，試驗(yàn)組攻毒的濃度為104 TCLD；種質(zhì)影響試驗(yàn)中，試驗(yàn)組攻毒的濃度為103 TCLD。對(duì)照組同樣設(shè)置3個(gè)平行，注射等量體積的生理鹽水。

病毒注射后便開(kāi)始正式試驗(yàn)，及時(shí)觀察魚(yú)體活動(dòng)情況，并記錄死亡情況及時(shí)撈出死亡個(gè)體。死亡標(biāo)準(zhǔn)為觸碰無(wú)任何反應(yīng)。

1.4 計(jì)算公式

試驗(yàn)結(jié)束后按以下公式計(jì)算：

累積病死率（cumulative mortality,CM）=（累計(jì)死亡魚(yú)尾數(shù)/攻毒魚(yú)尾數(shù)）×100%

2 結(jié)果

斑點(diǎn)叉尾 注射CCV后，觀察發(fā)現(xiàn)大部分魚(yú)體均出現(xiàn)不同程度的感染現(xiàn)象，前期主要出現(xiàn)魚(yú)集群聚集在角落，部分魚(yú)在水中急促緊張游動(dòng)，出現(xiàn)打轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，最后倒立在水中死亡。體表發(fā)現(xiàn)鰭條基部、尾柄、肌肉有出血點(diǎn)，腹腔膨大，單側(cè)或雙側(cè)眼球凸出，腮絲發(fā)白，表皮發(fā)黑。解剖后腹腔內(nèi)有黃褐色積水，腸道呈現(xiàn)灰白色，肝、脾腫大且有出血點(diǎn)，腎也發(fā)現(xiàn)有出血。

2.1 溫度對(duì)CCVD暴發(fā)的影響

斑點(diǎn)叉尾 在注射CCV之后，由于魚(yú)體自身免疫和病毒劑量的關(guān)系48 h內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)死亡。高溫度組（18℃）第3天開(kāi)始開(kāi)始出現(xiàn)死亡，低溫度組（10攝氏度）第5天出現(xiàn)死亡。高溫度組的LC 50出現(xiàn)在第12天，低溫度組LC50出現(xiàn)在第13天，在第13天之后，高溫度組和低溫度組沒(méi)有明顯差異，高溫度組在17 d全部死亡，低溫度組在18 d全部死亡。至試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組全部存活。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溫度組斑點(diǎn)叉尾累積病死率和累計(jì)病死數(shù)目

2.2 病毒濃度對(duì)CCVD暴發(fā)的影響

斑點(diǎn)叉尾 在注射CCV 20 h之后，105TCLD出現(xiàn)死亡，104TCLD組在攻毒后3 d出現(xiàn)死亡，103TCLD組在第8天才出現(xiàn)死亡。103組第八天開(kāi)始出現(xiàn)了暴發(fā)性死亡，從開(kāi)始死亡到全部死亡，用時(shí)10 d，與104TCLD和105TCLD接近。103TCLD，104TCLD，105TCLD組的LC50分別出現(xiàn)在第13天，第12天和第10天。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

2.3 種質(zhì)濃度對(duì)CCVD暴發(fā)的影響

為了突出種質(zhì)的區(qū)別，試驗(yàn)中選取了正常的斑點(diǎn)叉尾 和白化斑點(diǎn)叉尾 作了對(duì)比試驗(yàn)。白化組在第3天開(kāi)始出現(xiàn)暴發(fā)性死亡，病程短，從出現(xiàn)死亡到全部死亡用時(shí)4 d，正常組在第8天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，病程較長(zhǎng)，全部死亡用時(shí)10 d。103TCLD攻毒時(shí)，正常組的LC50出現(xiàn)在第10天，白化組的LC50出現(xiàn)在第5天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

3 討論

該試驗(yàn)討論了溫度，病毒濃度和種質(zhì)對(duì)CCVD暴發(fā)的影響。

圖3 不同種質(zhì)組斑點(diǎn)叉尾累積病死率和累計(jì)病死數(shù)目

在溫度的試驗(yàn)中，10℃組和18℃組在暴發(fā)的時(shí)間上時(shí)有區(qū)別的，低溫組暴發(fā)遲緩。兩組實(shí)驗(yàn)中，從暴發(fā)到死亡所用的時(shí)間，也就是病程，并無(wú)很大區(qū)別，低溫組用時(shí)13 d，高溫組用時(shí)15 d。這說(shuō)明，溫度會(huì)影響病毒的復(fù)制，溫度升高會(huì)加快病毒的復(fù)制，但是，當(dāng)病毒達(dá)到一定的濃度時(shí)，溫度這一因子對(duì)疾病的暴發(fā)影響力并不大。與以往的研究不同，該次試驗(yàn)中，在10℃的試驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)了CCVD的暴發(fā)，這說(shuō)明在低于15℃時(shí)，CCVD是可能暴發(fā)的。

在觀察濃度對(duì)CCVD的暴發(fā)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)，低濃度組（103）暴發(fā)最晚；高濃度組（105）最先暴發(fā)。這證明，病毒在魚(yú)體內(nèi)達(dá)到一定的量，才會(huì)對(duì)魚(yú)造成傷害，CCVD暴發(fā)的時(shí)候，魚(yú)體內(nèi)的病毒已經(jīng)達(dá)到了一定濃度。高濃度的病毒作用下的是急性病毒病感染，個(gè)體免疫系統(tǒng)不能迅速地將所有的病毒清除，因此，短時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)較多的死亡，但是，由于個(gè)體差異，有些個(gè)體免疫反應(yīng)比較強(qiáng)，對(duì)病毒清除比較快，因此不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)一下都發(fā)病[5]。低濃度的病毒感染是慢性感染，病毒感染后，宿主有時(shí)間修復(fù)病毒造成的組織損傷，因此CCVD暴發(fā)需要長(zhǎng)時(shí)間的病毒復(fù)制才能實(shí)現(xiàn)，所以出現(xiàn)了暴發(fā)推遲，但是暴發(fā)的病程并沒(méi)有延長(zhǎng)，這是因?yàn)椴《驹谒拗黧w內(nèi)存在并不斷復(fù)制，發(fā)病時(shí)已經(jīng)達(dá)到了高濃度，并且由于慢性的病毒感染，已經(jīng)導(dǎo)致了部分器官的病變，因此病程不會(huì)延長(zhǎng)。

種質(zhì)對(duì)CCVD暴發(fā)影響的試驗(yàn)證明，種質(zhì)在對(duì)抗疾病中起到關(guān)鍵性作用。試驗(yàn)中使用了白化的斑點(diǎn)叉尾 ，在低濃度作用下，會(huì)迅速暴發(fā)引起死亡（第3天暴發(fā)VS正常組第8天暴發(fā)），病程極短（白化組病程4 dVS正常組病程10 d）。這說(shuō)明，種質(zhì)對(duì)CCVD暴發(fā)有很大的影響。種質(zhì)的差異，區(qū)別于個(gè)體的差異，是一種群體的表現(xiàn)，白化群體表現(xiàn)出來(lái)對(duì)CCVD抗性非常弱。這也說(shuō)明了選育抗病品質(zhì)的必要性和可行性。

綜合目前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)，CCV是一種傳播速度極快、危害十分嚴(yán)重的急性傳染病。感染后的致死率甚至能夠超過(guò)90%達(dá)到100%。大規(guī)模的暴發(fā)CCV將會(huì)給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前常用的CCV檢測(cè)手段主要是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的方式分離病毒，然后使用免疫熒光或PCR分子鑒定的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，但操作步驟過(guò)于繁瑣且周期較長(zhǎng)[6-7]。李惠芳等人建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法則大大提高的檢測(cè)速率和準(zhǔn)確性[8]。

在目前的技術(shù)條件下還沒(méi)有有效的治療方法來(lái)控制CCV，只能通過(guò)合理高效的管理手段來(lái)降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。從而將損失壓到最低。

首先要定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境進(jìn)行檢疫，尤其是苗種的產(chǎn)地檢疫。由于CCV是可以垂直傳播的，并且在病毒積累到一定量才會(huì)發(fā)病，因此，攜帶者就是暴發(fā)的危險(xiǎn)因子。一旦發(fā)現(xiàn)有攜帶CCV，應(yīng)該及時(shí)清除。其次，消毒，減少環(huán)境對(duì)魚(yú)的應(yīng)激，苗種孵化一定要采取消毒措施，對(duì)于已經(jīng)感染病毒的苗種要及時(shí)清除，使用的工具也要進(jìn)行銷毀。最后是新品種的培育。種質(zhì)在抗病中起到關(guān)鍵作用，不同的種質(zhì)對(duì)于疾病的敏感性不同，例如抗病基因的篩選（干擾素高表達(dá)品種），抗病SNP篩選等等[9]。因此，選育抗病新品種是預(yù)防CCVD暴發(fā)的關(guān)鍵[10]。