毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)

霍奕安，胡秀彩，呂愛(ài)軍，孫敬鋒

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院，創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)試驗(yàn)室，天津300384）

斑馬魚(yú)（Danio rerio）又名藍(lán)條魚(yú)、花條魚(yú)、斑馬擔(dān)尼魚(yú)等，是一種熱帶觀賞魚(yú)體長(zhǎng)4～6 cm，胚胎透明且體外發(fā)育，易于活體觀察，生長(zhǎng)發(fā)育快[1]。因此已經(jīng)成為生命科學(xué)中對(duì)疾病，遺傳和毒理學(xué)的理想模式生物[2]。隨著人類社會(huì)的迅速發(fā)展，工業(yè)上產(chǎn)生的各種廢棄物，如重金屬，工業(yè)污水，農(nóng)業(yè)上產(chǎn)生的農(nóng)藥、消毒液殘留等有害物質(zhì)通過(guò)雨水沖刷，或者直接向農(nóng)田施肥等途徑對(duì)土壤、魚(yú)類等產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，并且直接威脅到人類健康。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于魚(yú)類急性毒性的試驗(yàn)研究，經(jīng)常以鯉、金魚(yú)作為試驗(yàn)對(duì)象，斑馬魚(yú)還未被廣泛地應(yīng)用于藥物毒理學(xué)的研究[1-2]。近幾年，斑馬魚(yú)可作為監(jiān)測(cè)藥物靶器官的有效模型，而毒死蜱對(duì)于水生生物的急性毒性研究相對(duì)較少[3-6]。我國(guó)目前農(nóng)藥年產(chǎn)量已達(dá)到80萬(wàn)t，居于世界第2位[7-9]。毒死蜱是一種廣譜高效的有機(jī)磷殺蟲(chóng)、殺螨劑，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，對(duì)魚(yú)類和水生生物毒性較高毒[10-11]。該試驗(yàn)采用農(nóng)藥毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，獲得了毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)的基礎(chǔ)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖和魚(yú)病防治等提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

斑馬魚(yú)購(gòu)于天津市某花鳥(niǎo)市場(chǎng)，平均體長(zhǎng)3.9 cm，平均體質(zhì)量0.44 g。毒死蜱（有效成分含量40%，規(guī)格300 g，乳油劑型），購(gòu)自湖北仙隆化工股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

參照呂愛(ài)軍等[12]試驗(yàn)方法進(jìn)行，采用靜水法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。斑馬魚(yú)試驗(yàn)前在室內(nèi)馴養(yǎng)5 d以上，其自然病死率小于1%，試驗(yàn)前1 d停止投喂飼料，在試驗(yàn)期間不喂食。培養(yǎng)箱溫度為（25±2）℃，光照/黑暗為12 h/12 h。以毒死蜱配制7個(gè)不同濃度系列，并設(shè)1個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)濃度及對(duì)照組隨機(jī)放入10尾斑馬魚(yú)。試驗(yàn)開(kāi)始后連續(xù)觀察8 h，并觀察和記錄魚(yú)的中毒情況（呼吸、反應(yīng)、平衡、游動(dòng)、體色變化）及96 h內(nèi)的死亡情況和開(kāi)始死亡時(shí)間與死亡數(shù)目。當(dāng)出現(xiàn)魚(yú)死亡時(shí)，及時(shí)撈出，以免污染水質(zhì)，觀察記錄魚(yú)體表特征與內(nèi)臟表面特征。試驗(yàn)時(shí)間是96 h，96 h后如果仍有活魚(yú)，則繼續(xù)試驗(yàn)至7 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用的是Bliss法來(lái)計(jì)算斑馬魚(yú)的半致死濃度LC50，安全質(zhì)量濃度用公式為

病死率=死亡試驗(yàn)魚(yú)數(shù)/試驗(yàn)魚(yú)總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒死蜱質(zhì)量濃度為1.3 mg/L時(shí)，5 h后有1條開(kāi)始出現(xiàn)失衡，偶爾急速竄游現(xiàn)象，12 h內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)死亡，死亡1條，鰓部有明顯出血現(xiàn)象，至24 h病死率為20%，到48 h已經(jīng)死亡70%，24～48 h是斑馬魚(yú)的集中死亡時(shí)段；毒死蜱質(zhì)量濃度達(dá)到1.4 mg/L時(shí)，72 h內(nèi)斑馬魚(yú)病死率達(dá)到100%；毒死蜱質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，7 h內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)身體出現(xiàn)明顯折彎現(xiàn)象，鰓部均有不同程度的出血，至12 h死亡6條，至48 h全部死亡。毒死蜱質(zhì)量濃度低于1.0 mg/L時(shí)，1周后仍有試驗(yàn)魚(yú)存活。各組的試驗(yàn)魚(yú)7 d時(shí)的病死率相比于96 h，在質(zhì)量濃度為0.9 mg/L和質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)出現(xiàn)變化，分別病死率從50%上升至80%、60%上升至90%。當(dāng)毒死蜱質(zhì)量濃度為0.6 mg/L時(shí)，未出現(xiàn)試驗(yàn)魚(yú)死亡，說(shuō)明此時(shí)毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)的毒性作用比較?。ū?）。

表1 毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性作用（病死率） %

2.2 斑馬魚(yú)中毒表現(xiàn)及死亡特征

毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)中毒較快，反應(yīng)比較強(qiáng)烈。在低濃度梯度試驗(yàn)中，斑馬魚(yú)剛開(kāi)始放入時(shí)，一般都出現(xiàn)較為激烈的急速躥游現(xiàn)象，但隨后會(huì)消失，消失的時(shí)間長(zhǎng)短與濃度有關(guān)。適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境后，魚(yú)群積極游動(dòng)，偶爾會(huì)有集群現(xiàn)象，既而出現(xiàn)上浮、頂水、尾略下垂等現(xiàn)象。但是隨著中毒程度的愈來(lái)愈深，試驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)抽筋，時(shí)而翻肚、時(shí)而垂直于水面等失衡現(xiàn)象，或者沉于水底，并且呼吸加快加重或弓背，身體出現(xiàn)明顯折彎現(xiàn)象，漸漸地游動(dòng)能力減弱甚至喪失、反應(yīng)遲鈍、沉于水底，幾乎都會(huì)出現(xiàn)腮部出血直至死亡。

在高濃度梯度試驗(yàn)中，斑馬魚(yú)在開(kāi)始受藥的短短2～5 h中，出現(xiàn)強(qiáng)烈的急速竄游，嚴(yán)重失衡掙扎現(xiàn)象，甚至躍出水面。試驗(yàn)魚(yú)短時(shí)間內(nèi)鰓部出現(xiàn)明顯出血，繼而在水中打轉(zhuǎn)，直至死亡，身體有很明顯的折彎現(xiàn)象。高質(zhì)量濃度組相比于低質(zhì)量濃度組從斑馬魚(yú)受試中毒到死亡的間隔時(shí)間變短，中毒現(xiàn)象也更加明顯。

2.3 LC50值及質(zhì)量安全濃度（SC）

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算毒死蜱半致死濃度和質(zhì)量安全濃度值見(jiàn)表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，毒死蜱的安全質(zhì)量濃度為0.209 mg/L。參照GB/T 21281—2007我國(guó)化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚(yú)類毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（96 h LC50≤1.0 mg/L時(shí)為急性毒性Ⅰ級(jí)，1.0 mg/L≤96 h LC50≤10.0 mg/L為急性毒性Ⅱ級(jí)，10.0 mg/L≤96 h LC50≤100.0 mg/L為急性毒性Ⅲ級(jí)）[13]。毒死蜱的96 h LC50為0.926 mg/L，由此判定毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性為Ⅰ級(jí)。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[14]中農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類的毒性等級(jí)劃分（劇毒，96 h LC50≤0.1 mg/L；高毒，96 h LC50≤1.0 mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96 h LC50≤10.0mg/L；低毒，96 h LC50＞10.0 mg/L），可判定敵敵畏對(duì)斑馬魚(yú)為高毒。

表2 斑馬魚(yú)的LC50和SC

3 討論

近幾年，斑馬魚(yú)可作為監(jiān)測(cè)藥物靶器官的有效動(dòng)物模型，而毒死蜱對(duì)于水生生物的急性毒性研究相對(duì)較少[3-6]。趙于丁等[15]報(bào)道10種農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)的毒性與安全評(píng)價(jià)中，涉及到毒死蜱對(duì)于斑馬魚(yú)的毒性研究，結(jié)果顯示毒死蜱對(duì)于斑馬魚(yú)的24、48、72和96 h的半致死濃度分別為0.7943、0.7332、0.6434和0.5184 mg/L，并且斑馬魚(yú)對(duì)于毒死蜱的中毒癥狀為先興奮，后游動(dòng)遲緩或困難，得出的結(jié)果判定毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)為高毒。在該試驗(yàn)中，毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)的安全質(zhì)量濃度為0.209 mg/L，斑馬魚(yú)24、48、72和96 h的半致死濃度較高，這可能與斑馬魚(yú)品系、季節(jié)和氣溫等有關(guān)。斑馬魚(yú)對(duì)于毒死蜱的中毒癥狀相對(duì)一致，而且判定毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)均為高毒，可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖和魚(yú)病防治提供相對(duì)有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

馬軍國(guó)等[16]通過(guò)毒死蜱對(duì)于尖膀胱螺的急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒死蜱對(duì)尖膀胱螺24、48、72和96 h時(shí)的半致死濃度分別是0.577 mg/L、0.308 mg/L、0.243 mg/L和0.160 mg/L以及安全質(zhì)量濃度為0.016 mg/L，顯示毒死蜱對(duì)于螺類的毒性要大于斑馬魚(yú)。馬繼華等[17]報(bào)道毒死蜱對(duì)于南美白對(duì)蝦的急性毒性影響，結(jié)果表明對(duì)南美白對(duì)蝦24、48、72和96 h 的半致死濃度分別為 3.44 μg/L、2.08 μg/L、1.36 μg/L和0.89 μg/L以及安全質(zhì)量濃度為0.0089 μg/L，可見(jiàn)毒死蜱對(duì)于蝦類的毒性更加高。已有報(bào)道南美白對(duì)蝦表現(xiàn)出來(lái)的中毒癥狀有狂游和沖撞，在水中打轉(zhuǎn)；或者上下直竄，急速游動(dòng)。持續(xù)一段時(shí)間之后，體色開(kāi)始變白變淡，逐漸喪失游泳功能，失去平衡，躺臥在水底。南美白對(duì)蝦在高濃度梯度試驗(yàn)組中的中毒反應(yīng)很迅速，在短時(shí)間內(nèi)全部個(gè)體都出現(xiàn)明顯的中毒癥狀；而在低濃度試驗(yàn)組中，則要經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)時(shí)間之后才有個(gè)別受試蝦出現(xiàn)異常的癥狀。這與毒死蜱對(duì)于斑馬魚(yú)的中毒現(xiàn)象非常相似，尤其體現(xiàn)在魚(yú)體色變淡，出現(xiàn)急速竄游和失衡等現(xiàn)象。

該研究結(jié)果表明，毒死蜱對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性為Ⅰ級(jí)，對(duì)斑馬魚(yú)的毒性等級(jí)為高毒。毒死蜱的安全質(zhì)量濃度為0.209 mg/L，因而毒死蜱對(duì)于斑馬魚(yú)的毒性較為強(qiáng)烈，不是斑馬魚(yú)的安全藥物，不建議用來(lái)作為殺滅寄生蟲(chóng)漁藥，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中需要謹(jǐn)慎使用。