樟樹果實多糖對巨噬細胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

吳靜，胡居吾，熊偉，顧震，王慧賓，Bae Young-soo,2，吳磊

（1.江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）（2.韓國江原大學森林與環(huán)境學院森林生物質(zhì)材料工程，江原道春川市 200-701）

免疫調(diào)節(jié)，作為人體內(nèi)的一種重要防御，在宿主防御病原體和抗原的入侵起到了重要的作用[1]。來自血單核細胞的巨噬細胞可以通過識別感染性病原體啟動先天免疫應答，從而抑制多種腫瘤細胞的生長和微生物的入侵[2,3]。多糖，作為最基本的生物大分子是由單糖組成，廣泛分布在動物、植物、藻類和真菌中。近年來，從天然資源中分離出的多糖已被證明具有廣泛的生物特性，如抗氧化、抗癌和免疫調(diào)節(jié)活性，已廣泛應用于食品和制藥工業(yè)中[4～6]。很多植物多糖已被視為重要的免疫調(diào)節(jié)劑，由于其沒有明顯的毒副作用而且能夠增強巨噬細胞的活化能力。一旦被激活，巨噬細胞可直接通過吞噬作用殺死病原體，并通過分泌一氧化氮、前列腺素 E2（PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等炎癥介質(zhì)間接地殺死病原體[7]。多糖介導的免疫細胞的刺激可以通過結(jié)合巨噬細胞膜受體（PRRs）如樹狀細胞凝集素-1(Dectin-1)、Toll樣受體(TLRs)、補體受體 3（CR3），并引發(fā)了一系列的信號轉(zhuǎn)導通路包磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），以及轉(zhuǎn)錄因子如核因子（NF）-κB和激活蛋白（AP）-1[8]。

樟樹（Cinnamomum camphora（L.）Presl.）又名香樟、烏樟、樟木、芳樟等，是樟科（Lauraceae)樟屬（Cinnamomum）常綠高大闊葉喬木。樟樹是我國重要的經(jīng)濟樹種和綠化樹種，在中國南部各省份廣泛分布，江西省將其命為“省樹”[9]。對該屬植物化學成分研究表明多含揮發(fā)油、多酚、黃酮、瑞諾烷類二萜、鞣質(zhì)、芳香性化合物、生物堿、木質(zhì)素、有機酸及多糖等成分[10～12]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，樟樹資源具有抑菌、消炎、止痛、抗癌、抗氧化及提高人體免疫力等藥用價值[13,14]。目前，素有中國最大的香精香料基地-“金溪縣”，對樟樹的開發(fā)利用中，很重要的一方面是對它的芳香資源的開發(fā)利用，而對于提取后的樟樹原料直接作為柴火進行焚燒，對其果實多糖的研究更是處于空白。本研究以樟樹果實多糖為研究對象，在細胞和分子水平上探討其免疫調(diào)節(jié)的潛在作用機制。為合理開發(fā)利用樟樹資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹果實于2017年3月上旬由江西思派思香料化工有限公司提供，江西省科學院應用化學研究所天然產(chǎn)物研究室李雄輝研究員鑒定為樟樹(Cinnamomum camphora（L.）Presl.)的果實。

二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（LPS）、甲氮甲唑藍（MTT）均購于Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、抗生素、胰蛋白酶、PBS（PH 7.4）和胎牛血清均購于Gibco公司；RIPA細胞裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH、iNOS、TNF-α、COX-2引物購于武漢博士德公司；ECL增強化學發(fā)光檢測試劑盒及微量 BCA蛋白定量試劑盒北京康為世紀生物科技有限公司；所需一抗購于美國Cell Signaling公司，二抗購于美國 Abcam公司；ELISA試劑盒購于 R&D Systems；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購于 Bio-Rad；十二烷基硫酸鈉、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、對氨基苯磺酰胺、無水乙醇均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YC-1800實驗室低溫噴霧干燥機，上海雅程儀器設備有限公司；H1850臺式高速冷凍離心機，廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；TD6A-WS PPR超速冷凍離心機，金壇區(qū)華城潤華實驗儀器廠；PCR擴增儀，ABI公司；電泳槽，Bio-Rad公司；FDU-1200冷凍干燥機，日本東京理化；Tecan infinite M200 PRO酶標儀，瑞士Tecan公司；Gel XP System伯樂凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；XD-202倒置生物顯微鏡，南京江南永新光學公司；Tanon5200數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；KQ-500B超聲波清洗儀，中國昆山超聲儀器有限公司；TGL-16GA CO2培養(yǎng)箱美國Thermo公司；Nanopure超純水系統(tǒng)，Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樟樹果實多糖的制備

將陰干的樟樹果實粉碎（3000.00 g），以 95%乙醇超聲提取3次，每次2 h，濾過，合并慮液，減壓回收乙醇，去除揮發(fā)性成分。將所得到的樟樹果實藥渣在室溫下陰干，去除乙醇殘留。以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1：50（m/V），100 ℃下熱回流提取兩次，每次提取2 h，離心取得上清液。將上清液進行噴霧干燥，進風口溫度125 ℃，出風口溫85 ℃，壓強0.4 MPa得樟樹果實多糖粗粉。將所得樟樹果實粗多糖在熱水中復溶解，溶液用 Sevag試劑[氯仿：正丁醇=5：1（V/V）]5：1除蛋白 3次，上層液體經(jīng)減壓濃縮去除Sevag試劑殘留，加入4倍體積95%乙醇，攪拌并于4 ℃冰箱過夜，離心收集多糖沉淀。將多糖沉淀溶解于蒸餾水，透析袋透析48 h，經(jīng)冷凍干燥后得到樟樹果實多糖（CCFP），放入冰箱備用。多糖含量經(jīng)苯酚硫酸法測定為62.36%，提取得率為3.3%。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和藥液配制

RAW 264.7細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）購得，用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將CCFP溶解于DMSO中，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成供試液濃度，所配制的藥液中DMSO含量不能超過0.1%。

1.3.3 細胞活性檢測-MTT法

采用MTT法[15]檢測細胞存活率。選取對數(shù)生長期 RAW 264.7 細胞，按 1×106個/mL、100 μL/孔接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，吸取舊培養(yǎng)基，加入待測藥物的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取舊培養(yǎng)基，于每孔中加入MTT工作液100 μL，繼續(xù)孵育3 h后每孔加入MTT終止液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后，用酶標儀在550 nm處測定OD值，實驗重復3次，計算細胞的相對存活率。相對細胞存活率=（實驗組孔吸光值-空白組孔吸光值）/（對照組孔吸光值-空白組孔吸光值）×100%。

1.3.4 CCFP對RAW264.7細胞NO、PEG2和TNF-α分泌的影響

將密度為1×105個/mL細胞接種于96孔板中，每孔100 μL置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，洗掉舊培養(yǎng)基，加入不同濃度供試藥物的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以加入1 μg/mL LPS處理的細胞作為陽性對照組。用Griess法[16]檢測細胞上清液中NO的分泌量，按ELISA檢測試劑盒操作方法測定TNF-α及PGE2的分泌量。

1.3.5 CCFP對RAW264.7細胞iNOS、COX-2及TNF-αmRNA表達的影響

將5×106個細胞放入直徑為40 mm的小培養(yǎng)皿（4 mL的培養(yǎng)基）培養(yǎng)16 h，吸去舊培養(yǎng)基，加入含有100 μg/mL的CCFP分別處理10 min、60 min、180 min、360 min后收集細胞。采用Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后擴增 cDNA。引物序列和RT-RCR條件如表1所示。

表1 引物序列及RT-PCR條件Table 1 Primer sequences and conditions for RT-PCR

1.3.6 細胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶基因測定

取對數(shù)生長期且細胞形態(tài)生長良好的 RAW264.7細胞，棄去舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，用刮板輕輕刮下輕輕吹打至單個細胞，采用臺盼藍法在顯微鏡下細胞計數(shù)，按5×105個細胞數(shù)目接種于小培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)基細胞用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒法向細胞中轉(zhuǎn)染NF-κB報告基因質(zhì)?；駻P-1報告基因質(zhì)粒。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去上清，再加入不同濃度梯度的CCFP處理細胞。熒光素酶活性采用試劑盒測定。

1.3.7 Western Blot檢測RAW264.7細胞因子的蛋白表達

取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，接種5×106個細胞于直徑為60 mm的4 mL培養(yǎng)皿中，于上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h。吸去舊的培養(yǎng)基，加入 100 μg/mL的CCFP分別處理不同的時間點后收集細胞。用RIPA裂解液法提取細胞蛋白，按 BCA試劑盒法制作標準曲線測定核蛋白濃度。移取 30 μL體系核蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，采用半干半濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于搖床，將膜取出，放在搖床上，1*TBS 10 mL清洗一次，10 min后倒掉，用3% BSA 5 mL室溫洗膜1 h后倒掉。TTBS 10 mL洗三次，每次10 min，一抗2.5 μL與5 mL 3%BSA混合清洗1 h后回收一抗，TTBS 10 mL洗三次，每次10 min倒掉，對應二抗Rabbit/mouse 2.5 μL+5 mL 3%BSA清洗1 h后倒掉。TTBS 10 mL洗三次，每次10 min后顯影。洗膜后加入辣根過氧化物酶試劑顯色，將混合液滴加到PVDF膜上，用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)進行化學發(fā)光成像。放入暗室預設曝光時間為30 s、60 s、90 s、120 s和5 min。檢測各組細胞蛋白表達水平。

1.3.8 結(jié)果分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均數(shù)±標準差(x±s)表示，各組之間的差異性采用單向方差分析通過統(tǒng)計軟件包 SPSS 19.0版，p＜0.05認為有顯著性差異，p＞0.05則無顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 樟樹果實多糖對炎癥因子釋放的影響

圖1 CCFP對RAW264.7細胞存活率及炎癥因子含量的影響Fig.1 The effects of CCFP on cells viability and the contents of cytokines secretion in RAW 264.7

為了研究樟樹果實多糖（CCFP）對 RAW264.7細胞活性的影響，本實驗采用MTT法檢測CCFP一定的濃度范圍內(nèi)細胞的存活率。結(jié)果如圖1（a）所示，在給藥范圍12.5～500 μg/mL內(nèi)，細胞存活率所呈現(xiàn)的趨勢與空白對照組相比基本一致，這說明CCFP在濃度12.5～500 μg/mL范圍內(nèi)對RAW 264.7細胞并無毒性，可進行下面的實驗研究。

細胞因子是細胞間的信號分子，由免疫和非免疫細胞分泌，在免疫反應中起到重要的作用?；罨木奘杉毎軌蜥尫糯罅康募毎蜃?，比如 NO，TNF-α和 PGE2。這些炎癥因子在細胞毒性/抑制細胞生長的機制中發(fā)揮著重要的作用[17,18]。因此，我們將NO的釋放水平作為免疫刺激中巨噬細胞活化的指標之一。NO的含量測定采用Griess試劑法，結(jié)果如圖1（b）所示，正常組中 RAW264.7細胞只釋放少量的 NO（3.12±0.12 μM），隨著給藥濃度的增加，RAW264.7細胞釋放NO的含量逐漸增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系。在給藥濃度為100 μg/mL時，NO的分泌量達到最大（53.53±4.25 μM）。另一方面，在給藥濃度在12.5～50 μg/mL范圍時，RAW264.7細胞釋放NO的含量比LPS組低，說明CCFP比LPS更溫和[19]，適合作為免疫調(diào)節(jié)劑。

TNF-α和PGE2兩個細胞因子是免疫刺激中巨噬細胞活化的另外兩個指標。為進一步探討CCFP如何作用于巨噬細胞，通過 ELISA試劑盒法檢測細胞內(nèi)TNF-α和PGE2細胞因子的分泌，結(jié)果如圖1（c和d）所示，在測試濃度范圍內(nèi)，CCFP能夠促進TNF-α和PGE2細胞因子的分泌，與NO分泌的結(jié)果一致都呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系。在給藥濃度為 100 μg/mL時，TNF-α和 PGE2的分泌量達到最大，分別為1008.32±35.23 pg/mL和434.56±25.23 pg/mL。為了排除CCFP污染而引起的炎癥因子釋放，我們向?qū)嶒灲M中加入內(nèi)毒素B（PolyB），實驗結(jié)果圖1（b-d）所示，內(nèi)毒素B（PolyB）能夠降低LPS激活巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子，而對CCFP激活巨噬細胞的炎癥因子并無影響，這表明CCFP并沒有污染。

2.2 CCFP對RAW264.7細胞炎癥因子基因表達的影響

iNOS是重要的內(nèi)源性免疫介質(zhì)之一，在正常的免疫功能中起重要作用，包括巨噬細胞的活化和宿主對細胞內(nèi)病原體的防御[20]。以上研究結(jié)果表明，CCFP能激活巨噬細胞分泌炎癥因子，接下來我們想確定CCFP是否對巨噬細胞中COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達有促進作用，用CCFP處理細胞10 min、30 min、60 min、180 min、360 min 后，COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達采用RT-PCR測定，如圖2所示。結(jié)果表明，CCFP能夠顯著誘導COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達并呈現(xiàn)一定的時效關(guān)系。與此同時，研究人員[21]發(fā)現(xiàn)多糖可以誘導RAW264.7產(chǎn)生NO、PGE2和TNF-α是通過上調(diào)iNOS、COX-2和TNF-αmRNA表達來完成的，這與2.1的研究結(jié)果基本一致。以上研究表明 CCFP通過調(diào)節(jié)細胞中 COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達來調(diào)節(jié)細胞中NO、PGE2和TNF-α的分泌量，這與Wu[22]和Shen[23]等研究的猴頭菇和麩皮多糖免疫調(diào)節(jié)活性機制一致。

圖2 CCFP對RAW264.7細胞炎癥因子iNOS、COX-2和TNF-α基因表達的影響Fig.2 The effect of CCFP on the expression of mRNAs of iNOS,COX-2, and TNF-α in RAW 264.7 cells

2.3 CCFP對TRL4介導的信號通路的影響

NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子，廣泛控制著細胞內(nèi)一些基因的表達包括iNOS，TNF-α和 IL-6，以及參與細胞凋亡，細胞衰老，炎癥與免疫等反應過程[24]。為進一步研究NF-κB和AP-1是否與CCFP誘導巨噬細胞 COX-2、iNOS和 TNF-α基因的表達有關(guān)，在RAW264.7細胞中構(gòu)建NF-κB-Luc和AP-1-Luc，采用熒光素酶報告基因檢測方法考察CCFP對RAW264.7細胞中NF-κB和AP-1的表達情況。結(jié)果（圖3a，b）：在沒有受到CCFP刺激的細胞，NF-κB和AP-1的表達量分別為1.00±0.12 和1.00±0.12，而經(jīng)12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL 的 CCFP 處理RAW264.7細胞后，NF-κB和AP-1的表達量顯著增加，分別為：6.32±1.24 和 2.34±1.45，12.45±2.56 和8.60±2.56，14.67±2.86 和 11.32±3.22，18.75±3.56 和14.56±3.78。這充分說明CCFP對巨噬細胞的激活作用是通過NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子的參與。

當受到多種細胞外刺激如LPS，促炎性細胞因子和多糖時，MAPKs蛋白激酶家族將會參與發(fā)起并激活NF-κF和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子活化[25]。最近研究報道，黃芪多糖、Sutherlandia frutescens多糖、靈芝多糖通過激活磷酸化MAPKs蛋白誘導細胞免疫反應[26]。

圖3 CCFP對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（a）和AP-1（b）的影響Fig.3 Effect of CCFP on the nuclear translocation of NF-κB (a)and AP-1 (b)

因此，為了解CCFP介導的巨噬細胞活化期3條關(guān)于MAPK的信號通路的蛋白表達情況。免疫印跡法檢測了ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化水平，圖4（a-b）研究結(jié)果表明，CCFP（100 μg/mL）誘導的巨噬細胞能夠迅速激活p-ERK MAPKs，并呈現(xiàn)時間依賴性關(guān)系。而JNK，p-JNK，p-38，p-p38，ERK的表達并無變化，說明 CCFP誘導細胞活化可能和激活p-ERK MAPK蛋白信號通路有關(guān)。這與之前的報道的黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)活性通過激活p-ERK MAPK蛋白信號通路機制一致[27]。Toll樣受體（TLR）在識別病原體和激活先天免疫中起著重要的作用，TLR4是在細胞膜上最先發(fā)現(xiàn)的Toll蛋白，可以識別革蘭氏陰性細菌脂多糖（LPS）[28]，它在增強天然免疫應答和多糖誘導的細胞因子產(chǎn)生中起著重要作用。此外，相關(guān)研究證實天然多糖如黃精多糖[29]，菌菇多糖[30]，黃芪多糖[31]誘導巨噬細胞主要是通過與TLR4受體結(jié)合，更重要的是，TLR4一旦被激活，它能夠促進細胞內(nèi)信號通路傳導從而激活相關(guān)蛋白，如 ERK、JNK和p38蛋白的激活，以及轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1的表達[32]。本研究通過免疫印跡法，對CCFP處理細胞不同時間點（5，10，30，60 min），結(jié)果如圖4（c-d）所示，TLR4受體蛋白表達隨著反應的進行而逐漸增強，研究結(jié)果表明TLR4受體是CCFP激活細胞的膜結(jié)合位點。同時可以說明CCFP通過與細胞膜上TLR4受體結(jié)合，向下引發(fā)一系列的級聯(lián)反應，從而激活巨噬細胞，釋放大量的炎癥因子。

圖4 CCFP對磷酸化ERK1/2，p-JNK，p38 MAPK(a)以及TLR4(b)蛋白表達的影響Fig.4 Effects of CCFP on the phospho-ERK1/2, the phospho-JNK, the phospho-p38 MAPK (a-b) and TLR4 (c-d)

3 結(jié)論

3.1 巨噬細胞是一種吞噬細胞，在先天免疫反應中起著關(guān)鍵作用，在宿主遇到病原微生物入侵時，巨噬細胞作為抗原提呈細胞（APC），將抗原遞呈給 T淋巴

細胞，誘導適應性免疫應答。此外，巨噬細胞在胚胎發(fā)生、腫瘤發(fā)生、皮膚創(chuàng)傷愈合和造血等方面也發(fā)揮著重要作用[33]。因此，巨噬細胞通常作為理想的細胞模型來評估活性物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)性能。

3.2 樟樹作為江西省省樹，在開發(fā)和利用上面還存在很多不足。尤其是以江西省金溪縣為主，雖然目前對樟樹中揮發(fā)性成分的提取和應用有了一定的規(guī)模，但對于提取后的殘渣并沒有物盡其用。本研究發(fā)現(xiàn)樟樹果實多糖對RAW264.7細胞的免疫調(diào)節(jié)活性首先通過與巨噬細胞 TRL4膜受體結(jié)合，誘導下游 p-ERK MAPKs蛋白的激活，NF-κB和 AP-1轉(zhuǎn)錄因子以及COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達的上調(diào)，從而釋放相應的NO，TNF-α和PGE2等炎癥因子。據(jù)文獻可知，本研究是首次以樟樹果實多糖為研究對象闡述其可能存在的免疫調(diào)節(jié)活性機制，為合理開發(fā)利用樟樹資源尤其是樟樹農(nóng)林廢棄物提供理論依據(jù)和參考。