新疆野生櫻桃李(Prunus cerasifera)葉黃酮類成分研究

劉偉，李紫薇，王航，楊鳳玲，李明璽，劉曉，萬春鵬

（1.伊犁師范學(xué)院，自治區(qū)教育廳普通高校重點(diǎn)實驗室，新疆伊寧 835000）（2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點(diǎn)實驗室，江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西南昌 330045）

野生櫻桃李(Prunus cerasifera)，也稱野酸梅，為薔薇科李屬落葉灌木或小喬木，是一種極為珍貴和罕見的且瀕危滅絕的原始野生林果，主要分布于高加索、小亞細(xì)亞及巴爾干半島，在我國僅分布于新疆天山伊犁河谷-大西溝和小西溝[1]。目前，已有新疆野生櫻桃李的扦插繁殖報道[2]，在新疆地區(qū)有多個人工栽培品種[3,4]。文獻(xiàn)報道新疆野生櫻桃李果實營養(yǎng)成分種類齊全，還原性糖、總糖和氨基酸等初級代謝產(chǎn)物含量豐富[5]，多酚[6]、花色苷[7]和總黃酮[8]等次級代謝產(chǎn)物及礦物質(zhì)[9]含量較高。野生櫻桃李多酚、總黃酮和花色苷具有很好的抗氧化活性[10,11]，前期研究發(fā)現(xiàn)野生櫻桃李枝、葉不同部位含有豐富的多酚和黃酮類化合物，他們具有較好的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性[12,13]；乙酸乙酯萃取部位多酚和總黃酮含量最高，且抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)，乙酸乙酯萃取部位為活性部位。綜上所述，目前對野生櫻桃李的化學(xué)成分研究僅限于總黃酮、多酚等的提取方面，前期我們也發(fā)現(xiàn)野生櫻桃李葉酸水解產(chǎn)物主要為山柰酚和槲皮素，說明山柰酚和槲皮素衍生物為野生櫻桃李的主要成分[14]，但對其多酚及黃酮類成分的系統(tǒng)分離及結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究還未見報道。

本文采用各種柱層析技術(shù)對野生櫻桃李葉甲醇提取物乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行系統(tǒng)分離純化，采用核磁共振波譜技術(shù)鑒定了分離的化合物結(jié)構(gòu)，從野生櫻桃李葉乙酸乙酯萃取部位中共分離并鑒定了 11個黃酮類化合物，所有黃酮類化合物均為首次從新疆野生櫻桃李葉中分離鑒定，槲皮素和山柰酚糖苷類成分是野生櫻桃李葉中主要的黃酮類成分。本研究為野生櫻桃李的綜合開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生櫻桃李葉于2015年10月采自新疆伊犁霍城縣大西溝，經(jīng)伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所趙玉教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李(Prunus cerasifera)；環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜甲醇為Sigma公司產(chǎn)品；聚苯乙烯型MCI GEL CHP20P (75～150 μm)填料為日本三菱化學(xué)公司產(chǎn)品；Sephadex LH-20凝膠為GE公司產(chǎn)品；ODS反向硅膠柱為YMC公司產(chǎn)品；所有色譜填料均購自北京慧德易科技有限責(zé)任公司；制備HPLC色譜柱為菲羅門Luna C18（250 mm×10 mm，5 μm）；氘代甲醇試劑購自青島騰龍微波科技有限公司。

1.2 主要儀器

布魯克400 MHz型核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪)，冷凍干燥機(jī)(東京理化)，日立制備高效液相色譜儀系統(tǒng)包括L2130泵，L-2200自動進(jìn)樣器，L-2455二極管陣列檢測器等。

1.3 提取分離方法

2 kg野生櫻桃李葉，實驗室攤放陰干后，60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥2 h，粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩。野生櫻桃李葉粉末每次用10 L甲醇室溫浸泡提取3次，合并3次提取液后過濾，減壓濃縮，得甲醇提取物210 g。取200 g提取物浸膏溶解于4 L蒸餾水中，依次用等體積的環(huán)己烷、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取三次，分別合并萃取液后減壓濃縮。根據(jù)前期抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性測試結(jié)果[12,13]，直接選取乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行后續(xù)黃酮類成分分離。

乙酸乙酯萃取物溶解于適量超純水中，離心，取上清液上于MCI柱、依次采用超純水、30%甲醇、50%甲醇和90%甲醇梯度洗脫，收集醇洗脫部位得到4個流分(EPA-EPD)。EPB流分采用硅膠柱分離，氯仿和甲醇混合溶劑梯度洗脫（100：1，50：1，30：1，20：1，10：1，8：1，6：1，4：1，2：1，V/V），經(jīng)薄層層析及 HPLC分析合并為 7個流分(EPB1～EPB7)。EPB4流分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離（甲醇洗脫）后相應(yīng)流分再經(jīng)半制備液相分離純化得到化合物1，2，5，6，8，9和10。EPB5流分經(jīng)C18中壓色譜(MPLC)分離，甲醇：水梯度洗脫后再經(jīng)半制備液相分離純化得到化合物3，4，7和11。HPLC二極管陣列檢測器采集化合物的紫外吸收光譜，化合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，冷凍干燥得到固體粉末，化合物溶解于氘代甲醇用于后續(xù)NMR測試。

2 結(jié)果與討論

槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(1)黃色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=256, 356 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.51 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-2'),7.47 (1H, dd,J= 7.6, 1.6 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5'), 6.37 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-8), 6.18 (1H, d,J=1.4 Hz, H-6), 5.45 (1H, s, H-1"), 4.32 (1H, d,J= 2.4 Hz,H-5"), 3.88 (2H, m), 3.49 (2H, m)?；衔?的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），根據(jù)1H和13C-NMR數(shù)據(jù)確定化合物1為槲皮素糖苷，查閱文獻(xiàn)，化合物1的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道的槲皮素呋喃阿拉伯糖苷一致，確定化合物1為槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

槲皮素-3-O-β-D-木糖苷(2)黃色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=255, 358 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.59 (1H, brs, H-2'), 7.57 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6'), 6.84 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5'), 6.37 (1H,brs, H-8), 6.18 (1H, brs, H-6), 5.16 (1H, d,J= 7.2 Hz,H-1"), 3.06-3.79 (5H, m, H-2"-5")?；衔?的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物1類似，也為槲皮素糖苷，化合物2的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），查閱文獻(xiàn)，化合物2的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道的槲皮素-3-O-β-D-木糖苷一致，確定化合物2為槲皮素-3-O-β-D-木糖苷。

槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(3)黃色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=257, 356 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.82 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2'),7.58 (1H, dd,J= 1.8, 8.4 Hz, H-6'), 6.85 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5'), 6.39 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,J=1.6 Hz, H-6), 5.15 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1"), 3.82 (1H,m), 3.78 (1H, d,J= 7.8 Hz), 3.64 (1H, m), 3.54 (2H, m),3.45 (1H, m)?；衔?的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物1，2類似，也為槲皮素糖苷，化合物3的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），查閱文獻(xiàn)，化合物3的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道的一致，確定化合物3為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷。

槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)黃色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=256, 356 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.31 (1H, brs, H-2'), 7.29 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-6'), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5'), 6.36 (1H,d,J= 1.0 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,J= 1.0 Hz, H-6), 5.33(1H, s, H-1"), 4.20 (1H, s), 3.72 (1H, m), 3.58 (1H, brs),3.39 (1H, m), 0.92 (3H, d,J= 6.0 Hz, CH3)?；衔?的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物1，2類似，也為槲皮素糖苷，δ 0.92 (3H, d,J= 6.0 Hz, CH3) 提示為鼠李糖。13C-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)一步（見表1）證實其為鼠李糖[17]，確定化合物4為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(5)黃色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 7.93 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2', 6'),6.90 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3', 5'), 6.37 (1H, s, H-8), 6.18(1H, s, H-6), 5.46 (1H, s, H-1"), 4.30 (1H, d,J= 2.4 Hz,H-5"), 3.89 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.47 (2H, m)?；衔?的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），根據(jù)1H和13C-NMR數(shù)據(jù)確定化合物5為山柰酚糖苷，化合物5的糖基與化合物1類似，化合物5的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道一致，確定化合物5為山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

山柰酚-3-O-β-D-木糖苷(6)黃色粉末；UV-vis(MeOH)λmax=265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 8.01 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2', 6'),6.86 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3', 5'), 6.38 (1H, s, H-8), 6.19(1H, s, H-6), 5.17 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1"), 3.06-3.76(5H, m, H-2"-5")?；衔?的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物5類似，也為山柰酚糖苷，化合物6的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），根據(jù)13C-NMR數(shù)據(jù)確定化合物6的糖基與化合物2類似，也為木糖苷；化合物6的NMR數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[18]中山柰酚-3-O-β-D-木糖的NMR數(shù)據(jù)一致，確定化合物6為山柰酚-3-O-β-D-木糖苷。

山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)黃色粉末; UV-vis(MeOH)λmax=265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)： 8.04 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2', 6'),6.87 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3', 5'), 6.39 (1H, s, H-8), 6.19(1H, s, H-6), 5.24 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1"), 3.68 (1H, dd,J= 1.8, 11.8 Hz, H-6"), 3.51 (1H, dd,J= 5.4, 11.8 Hz,H-6"), 3.31-3.42 (3H, m, H-2", 3", 4"), 3.19 (1H, m,H-5")?；衔?的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物5類似，也為山柰酚糖苷，化合物7的1H-NMR數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[18]中山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的1H-NMR數(shù)據(jù)一致，確定化合物7為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8)黃色粉末；UV-vis(MeOH)λmax= 265, 347 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz) 7.75 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2', 6'),6.91 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-3', 5'), 6.36 (1H, s, H-8), 6.18(1H, s, H-6), 5.36 (1H, s, H-1"), 4.20 (1H, brs), 3.70 (1H,m), 3.60 (1H, brs), 3.33 (1H, m), 0.90 (3H, brs, CH3)提示為鼠李糖苷；化合物8的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），化合物 8的 NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道的山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷一致，確定化合物 8為山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

反式-二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(9)白色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=220, 286 nm。1H-NMR (400 MHz,CD3OD, δ, ppm,J/Hz)7.34 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2', 6'),6.77 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 6.22 (1H, d,J= 1.8 Hz,H-8), 6.19 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 5.47 (1H, s, H-1"),5.38 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2), 4.21 (1H, d,J= 2.2 Hz,H-3), 3.77 (1H, dd,J= 3.2, 9.4 Hz), 3.53 (1H, m), 3.43(1H, t,J= 9.4 Hz), 3.29 (1H, m), 1.22 (3H, d,J= 6.0 Hz,CH3) 提示為鼠李糖苷；化合物9的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物8類似，化合物9多兩個質(zhì)子信號5.38 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2), 4.21 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-3)，化合物9的13C-NMR數(shù)據(jù)（見表1），提示化合物9為二氫山柰酚糖苷?；衔?的NMR數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[19]中二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的NMR數(shù)據(jù)基本一致，根據(jù)H-2和H-3的耦合常數(shù)(J= 2.2 Hz)，確定其為反式結(jié)構(gòu)[20]，化合物9為反式-二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

順式-二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(10)白色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=220, 286 nm。1H-NMR (400 MHz, CD3OD, δ, ppm,J/Hz)7.34 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2', 6'), 6.82 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 6.20 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-8), 6.15 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-6), 5.46 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-1"), 5.01 (1H, d,J= 11.7 Hz, H-2), 4.56(1H, d,J= 11.7 Hz, H-3), 3.77 (1H, dd,J= 3.2, 9.4 Hz),3.53 (1H, m), 3.43 (1H, t,J= 9.4 Hz), 3.29 (1H, m), 1.21(3H, d,J= 6.1 Hz, CH3) 提示為鼠李糖苷；化合物10的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物9非常類似，主要的區(qū)別在于H-2和H-3的耦合常數(shù)不同，化合物10中H-2和H-3的耦合常數(shù)為J= 11.7，確定其為順式結(jié)構(gòu)[20]。確定化合物10為順式-二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

順式-二氫山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(11)白色粉末；UV-vis (MeOH)λmax=220, 286 nm。1H-NMR (400 MHz, CD3OD, δ, ppm,J/Hz)7.35 (2H, d,J= 8.1 Hz,H-2', 6'), 6.82 (2H, d,J= 8.1 Hz, H-3', 5'), 6.17 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-8), 6.14 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 5.02 (1H,dd,J= 4.3, 11.7 Hz, H-2), 4.58 (1H, d,J= 3.5, 11.7 Hz,H-3), 4.91 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1"), 3.98 (1H, m), 3.89(1H, dd), 3.52 (1H, m), 3.38 (3H, m)?；衔?1的1H-NMR數(shù)據(jù)與化合物10類似，也為順式-二氫山柰酚糖苷類化合物，化合物11的1H-NMR數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[21]中二氫山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的1H-NMR數(shù)據(jù)一致，確定化合物 11為順式-二氫山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

表1 黃酮類化合物1-6和8的13C-NMR數(shù)據(jù)(100 MHz，CD3OD)Table 1 13C-NMR data of flavonol compounds1-6 and 8 (100 MHz, CD3OD)

3 結(jié)論

采用各種柱層析技術(shù)從野生櫻桃李葉醇提取物乙酸乙酯萃取部分中共分離并鑒定了 11個黃酮類化合物，他們分別為：槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(1)，槲皮素-3-O-β-D-木糖苷(2)，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(3)，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)，山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(5)，山柰酚-3-O-β-D-木糖苷(6)，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8)，反式-二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(9)，順式-二氫山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(10)，順式-二氫山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(11)。所有黃酮類成分均為首次從新疆野生櫻桃李葉中分離鑒定，槲皮素和山柰酚糖苷是其主要的黃酮類成分。本研究為野生櫻桃李的綜合開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。