大豆皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)及分析方法的研究進(jìn)展

薛鵬，趙雷，鄭星，張豐香，任貴興

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東濰坊 261053）（2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

大豆Glycine max(Linn.) Merr.豆科植物大豆屬大豆。大豆原產(chǎn)地中國，主要食用大豆的果實，古代稱菽，《詩經(jīng)》、《史記》、《本草綱目》等皆有記載?！堆幽昝劁洝分杏涊d：“服食大豆，令人長肌膚、益顏色、填骨髓、加氣力、補(bǔ)虛能”。目前，大豆可以生產(chǎn)各類型的加工產(chǎn)品，如豆?jié){、豆腐、豆粉、腐乳、納豆、豆油、飼料級生物燃料。據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計大豆產(chǎn)量居世界第三，僅次于玉米和水稻。大豆（包括黑豆、青豆和黃豆）含有豐富的蛋白，油脂和膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，也富含一系列的生物活性物質(zhì)，如異黃酮、大豆皂苷、菲汀和多酚等[1～3]。雖然大豆具有豐富的營養(yǎng)價值和顯著的生物活性，仍有很多人難以食用大豆。因皂苷、多酚和異黃酮等物質(zhì)會產(chǎn)生苦澀感，不利于食用[2,4]。

目前對大豆皂苷的藥理活性限于大豆皂苷混合物，很少有大豆皂苷具體結(jié)構(gòu)活性研究的報道。大豆皂苷粗品具有抗誘變[5]、抗衰老[6]、抗癌[7,8]、降血糖[9]、降血脂[10,11]、抗炎[12,13]、腎素抑制劑[14]、抗凝血[15]和抗病毒[16]等活性。雖大豆皂苷也已部分應(yīng)用于化妝品、食品及藥品行業(yè)，但因大豆皂苷在含量較低，對照品稀缺，結(jié)構(gòu)性質(zhì)不利于光譜檢測等因素，造成了無法工業(yè)化大豆皂苷單體，無法對大豆粗皂苷成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性與定量分析，無法明確大豆皂苷結(jié)構(gòu)與其活性之間的關(guān)系等難題，限制了大豆皂苷的進(jìn)一步開發(fā)利用。

雖然相關(guān)期刊發(fā)表大豆皂苷的相關(guān)結(jié)構(gòu)及藥理活性的綜述；但存在以下幾點不足之處：1.發(fā)表時間較早，缺少近期發(fā)現(xiàn)的新型皂苷；2.對皂苷的具體結(jié)構(gòu)描述較少，無法判斷皂苷的具體結(jié)構(gòu)；3.尚未對大豆皂苷的檢測方法進(jìn)行綜述，無法為大豆皂苷的定量定性提供參考；4.藥理活性多為大豆粗皂苷，沒有準(zhǔn)確標(biāo)定大豆各類型皂苷結(jié)構(gòu)及含量，無法闡述其物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本文對大豆皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)及分析方法進(jìn)行綜述研究，為大豆加工應(yīng)用和皂苷的檢測提供理論支持；特別是為大豆皂苷的檢測鑒定提供技術(shù)性參考。

1 皂苷構(gòu)型

皂苷多數(shù)可溶于水，因其水溶液震蕩及搖晃后能產(chǎn)生大量持久性肥皂樣泡沫故稱之為皂苷，且絕大部分皂苷具有苦澀味。大豆中皂苷含量為0.6%～6.5%，野生大豆含量為2.1%～6.9%，隨著種子萌發(fā)其皂苷含量增加2倍[17,18]。大豆籽粒中不同的部位皂苷含量也有所差異，胚中的含量為1.7%～8.3%，子葉的含量略低于胚為5.0%～6.1%[19]。大豆皂苷為五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷，根據(jù)其苷元結(jié)構(gòu)及連接糖苷結(jié)構(gòu)的不同，大豆皂苷種類已過百種[19～25]。目前根據(jù)其苷元結(jié)構(gòu)類型，把大豆皂苷分為A、B、DDMP、E、H、I、J等七類。以C-21結(jié)合C-22及C-29的連接官能團(tuán)的類型為基礎(chǔ)，可以把上述七類皂苷歸納為三類，分別為A、B及Sg-6。如圖1所示，大豆皂苷中的糖苷結(jié)構(gòu)有一定的規(guī)律性主要由β-D-半乳糖（Galactose，Gal）、β-D-葡萄糖（Glucose，Glc）、β-D-木糖（Xylose，Xyl）、α-L-鼠李糖（rhamnose monohydrate，Rha）、α-L-阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、β-D-葡萄糖醛酸（Glucuronic acid，GlcUA）及與特定酸形成的糖脂類等組成。

1.1 大豆皂苷A型

A型大豆皂苷是以大豆皂醇A（3β，21β，22β，24-四羥基-齊墩果烷-12-烯）為母核結(jié)構(gòu)，C-3和C-22同時結(jié)合糖苷的雙糖鏈型皂苷。目前 A型皂苷根據(jù)C-22糖苷的不同分為：Aa系列（Aa，Au，Ae，Ax，Ay 及 Ag），Ab（Ab，Ac，Af，Ad，Az 及 Ah）和A0 系列（A0-αg，A0-βg，A0-γg，A0-αa，A0-βa，A0-γa）。上述系列的大豆皂苷配基C-22糖苷分別結(jié)合-阿拉伯糖-2,3,4-三乙?；?木糖（-Ara-acetylXyl）；-阿拉伯糖-2,3,4-三乙酰化基-葡萄糖及-阿拉伯糖（-Ara）[20]。有學(xué)者從野生大豆分離出三種新型的A型大豆皂苷，由C-29結(jié)合羥甲基取代一個氫原子形成Hab-αg；由Aa（Ab或 A0-αg）C-22位糖苷水解成羥基形成的A-αg；及A-αg的C-29發(fā)生酯化反應(yīng)形成乙?；〈?KA-αg[24,25]。

1.2 大豆皂苷B型

B型大豆皂苷是以大豆皂醇 B（3β，22β，24-三羥基-齊墩果烷-12-烯）為母核結(jié)構(gòu)，C-3結(jié)合糖苷的單糖鏈型皂苷。目前根據(jù)C-22的官能團(tuán)的不同主要分為：DDMP 型（αg，βg，γg，αa，βa，γa），B 型（Ba，Bb，Bb’，Bx，Bc，Bc’），和 E 型皂苷（Bd，Be，Be’，Bf，Bg，Bg’）。DDMP型大豆皂苷較為特殊，是在大豆皂醇B配基上，C-22結(jié)合一個DDMP環(huán)（2,3-二氫-2,5-二羥基-6-甲基-4氫-吡喃-4-酮）；此外，C-22結(jié)合羥基為典型的B類皂苷，羥基氧化成酮為E類皂苷。DDMP型皂苷被認(rèn)為是大豆中皂苷的原始形態(tài)，對提取條件比較苛刻，在Fe3+存在的情況下，極易被氧化成B型或E型皂苷[26]。此外，大豆B型皂苷中還含有常見的大豆皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。

1.3 大豆皂苷Sg-6型

圖1 大豆皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure and nomenclature of soyasaponins

Sg-6型皂苷首次從野生大豆中分離，因此類型皂苷形成與大豆植株內(nèi)的Sg-6基因表達(dá)有關(guān)，故稱Sg-6型蛋白[27,28]。這類皂苷的特點為C-22的直接成為酮，C-29具有明顯取代，29位碳甲基連接到20位碳；以C-20甲基被羥甲基（CH2OH-）、甲酸（-COOH）、丙二酸（-CH2OOCCOOH）取代形成 H（H-αg，H-βg，H-γg，H-αa，H-βa，H-γa）、I(I-αg，I-βg，I-γg，I-αa，I-βa，I-γa)、J(J-αg，J-βg，J-γg，J-αa，J-βa，J-γa)型皂苷；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)C-20位會被甲酯（CH3COO-）取代。

Sg-6型皂苷含量很低，因為并非所有的野生型大豆都含有 Sg-6基因，研究發(fā)現(xiàn)中國野生型大豆中有17.6%、韓國有10.0%、而日本僅有1.0%能夠檢測到大豆皂苷Sg-6存在[28]。

圖2 其他新型化合物結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of saponins compents newly

表1大豆皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)Table.1 Chemical structure and nomenclature of soyasaponins

2 檢測方法

根據(jù)大豆皂苷定量定性原則為基礎(chǔ)，將分析型檢測手段分為兩種。一種是分離型檢測型的定量手段：如包括薄層色譜（Thin Layer Chromatography）、高效液相(High Performance Liquid Chromatography)、超高壓液相（Ultra Performance Liquid Chromatography），氣相（Gas Chromatography）。

另一種是基于不進(jìn)行分離的定性分析的檢測方法：核磁共振技術(shù)（Nuclear Magnetic Resonance）、高速逆流色譜(High-speed Countercurrent Chromatography)、質(zhì)譜（Mass Spectrometry）、代謝組學(xué)指紋圖譜、免疫方法分析組成。值得注意的是質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)即是重要的定性手段也是常用的定量手段。

2.1 薄層色譜（TLC）

薄層色譜是基本的色譜技術(shù)，因其具有操作簡便，通用性強(qiáng)，分離速度快及成本低廉等特點；至今仍是鑒別與快速分析的首要選擇，也是我國藥典一部中最常用的方法。早期關(guān)于大豆皂苷的分析分離鑒定都是利用薄層色譜法[19～22]。利用薄層色譜可判斷大豆醬在發(fā)酵過程中各類皂苷的種類及其含量變化，以判斷和發(fā)掘新的作物品種與皂苷類型[28,29,30]。

2.2 高效液相（HPLC）和超高壓液相方法（UPLC）

HPLC作為一種通用性分析儀器，常常配合不同的檢測器以完成檢測任務(wù)；這些檢測器包括紫外檢測器（UV）、二極管陣列檢測器（DAD）、蒸發(fā)光散檢測器（ELSD）、荷電氣溶膠檢測器（CAD）、脈沖安培檢測器（PAD）以及質(zhì)譜（MS）。因MS檢測器較為特殊，會單獨一節(jié)討論。

UV和DAD檢測器由于其性價比較高，現(xiàn)已成為HPLC的標(biāo)配。由于大豆皂苷缺少發(fā)色團(tuán)，僅能夠末端吸收，大多數(shù)檢測波長僅限201～205 nm。在此波長下極易產(chǎn)生噪音并造成基線的不穩(wěn)，因此大部分圖譜結(jié)果僅可用于定性和分離[20～22,31]。隨著HPLC系統(tǒng)穩(wěn)定性增強(qiáng)及分析柱填料的改進(jìn)，HPLC-UV檢測器也用于皂苷類成分的檢測。Hubert利用HPLC-UV分析了不同材料大豆子葉和胚中 B類大豆皂苷含量[32]。DAD檢測器同時產(chǎn)生幾個波長對樣品進(jìn)行檢測分析，增加了分析結(jié)果的可靠性，但相對于單一波長的 UV靈敏度略有下降，主要組方中多種有效成分的含量測定[34]。

ELSD主要用于非揮發(fā)性成分。因其克服了由于紫外檢測器對溶劑系統(tǒng)的吸收，即使是梯度洗脫，輸出的基線依然穩(wěn)定。Lin利用HPLC-ELSD，建立了檢測大豆中主要大豆皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ含量的提取方法和檢測條件[34]。通過利用HPLC-ELSD還可以測定大豆樣品中大豆皂苷的總量[35]。

DAD也用于皂苷類物質(zhì)的檢測。這種檢測器在對皂苷類的檢測與分析展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價值，如人參[36]。但在大豆皂苷的檢測中應(yīng)用較少。

UPLC是HPLC系統(tǒng)的升級版，具備分析時間短，分離效果好的特點。往往用于樣品的快速檢測與分析。選用HPLC和UPLC兩種分析系統(tǒng)同時測定血栓通注射液中5種皂苷成分，UPLC分析過程僅需要15 min，而HPLC則需要80 min[37]。

2.3 氣相色譜（GC）

氣相色譜法具有無有機(jī)溶劑、高分離效率和分析時間短等特點，皂苷水解后的苷元可以利用GC法進(jìn)行分析[38]。然而GC往往用于易揮發(fā)樣品的研究，這便限制了GC對皂苷類化合物的應(yīng)用。

2.4 質(zhì)譜（MS）

隨著聯(lián)用關(guān)鍵技術(shù)和質(zhì)譜檢測器的不斷發(fā)展，現(xiàn)已是各類成分定性定量檢測分析的重要手段；MS直接針對分析物質(zhì)的荷質(zhì)比，具有目的性強(qiáng)，特別適應(yīng)對皂苷這種無特定紫外吸收、難揮發(fā)的物質(zhì)。MS主要作為一種檢測器多與HPLC、UPLC、GC等分離系統(tǒng)聯(lián)用聯(lián)用。質(zhì)譜與分離系統(tǒng)的聯(lián)用，便伴隨著溶劑祛除和分析物離子化的進(jìn)行。電子噴霧電離源（ESI）及電子轟擊電離源（EI）是常用離子源；三重四級桿(QtQ)，及飛行時間檢測器（TOF）是常用檢測器。多重串聯(lián)色譜（MS/MS、MSn）聯(lián)用技術(shù)也越來越多的應(yīng)用于檢測分析領(lǐng)域，串聯(lián)不同的類型的 MS，可獲得更詳細(xì)的離子峰信息。

Krishnamurthy等[28]人利用HPLC-ESI-MS(Q)發(fā)現(xiàn)發(fā)芽后野生大豆中的皂苷含量是發(fā)芽前含量的1.5倍，并可同時檢測出各類型大豆皂苷的含量。利用HPLC-ESI-MS/MS能夠準(zhǔn)確快速的提供糖苷類化合物的分子量和糖苷部分的有益信息，可以探究出大豆皂苷的質(zhì)譜的裂解規(guī)律[38]。脫脂后的大豆可以采用乙醇提取，正丁醇萃取，乙酸乙酯沉淀的方法及大孔樹脂洗脫，獲得粗皂苷提取物，進(jìn)而利用 HPLC-APCI-MS來鑒定粗皂苷類型及含量[39,40]。TOF因具有高分辨率、測量范圍大等優(yōu)點，適應(yīng)于對未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定也適應(yīng)于皂苷類化合物的代謝研究。大豆皂苷在人體腸道細(xì)菌作用下會逐步水解糖鏈形成苷元[41]。Chitisankul[42]利用HPLC-MS/MS探究了，在制備豆?jié){時，大豆中的DDMP類皂苷會因大豆酚的作用而被降解。關(guān)于大豆皂苷的生物轉(zhuǎn)化、水解作用等研究等會利用MS進(jìn)行分析檢測[43,44]。

2.5 高速逆流色譜（HCCC）

HCCC是一種液-液色譜分離技術(shù)，具有無可逆吸附，無樣品損失、無試劑污染、可快速和大制備量分離等優(yōu)點，常常用于標(biāo)準(zhǔn)品的制備。黃等采用高速逆流色譜結(jié)合制備型高效液相色譜法分離制備了大量的大豆皂苷單體[45]。

2.6 核磁（NMR）

核磁共振技術(shù)（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）在最終鑒定人參皂苷單體強(qiáng)有力的定性分析工具，所有皂苷化合物結(jié)構(gòu)的鑒定基本都應(yīng)用到 NMR技術(shù)。但是需要樣品純度較高，使用氘代試劑溶劑，目前僅在大豆皂苷結(jié)構(gòu)鑒定中使用[45,46]。

2.7 其他檢測技術(shù)

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophores）及免疫分析（Immunoassay）也會用于皂苷類化合物的分析。毛細(xì)管電泳技術(shù)是基于物質(zhì)荷質(zhì)比，在毛細(xì)管電解質(zhì)中的移動速度不同來實現(xiàn)分離的。皂苷類物質(zhì)屬中性，不帶電需要特殊場來完成對皂苷的分析，如毛細(xì)管膠束電動色譜(MEKC)、微乳毛細(xì)管電泳色譜(MEEKC)。免疫分析法是一種可專一結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量檢測方法，目前使用的技術(shù)為酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、免疫印跡法、免疫熒光法。但是此兩種方法在測定大豆皂苷方面應(yīng)用較少，曾在其他皂苷類化合物的檢測中使用。王等通過反轉(zhuǎn)遷移膠束來實現(xiàn)皂苷的分離和富集，與傳統(tǒng)HPLC相比具有分析時間段、靈敏度高的優(yōu)點[47]。免疫法可以研究皂苷對人體作用通路及在植株各部位的分布[48,49]。

3 結(jié)論

大豆皂苷是豆科植物特別是大豆中的主要活性成分之一，具有顯著的生物活性，雖有一定的不適口感，仍廣泛應(yīng)用到食品添加劑、保健食品、減肥食品及化妝品等。如要進(jìn)一步開發(fā)利用大豆皂苷，仍需要解決幾點問題：1.大豆皂苷在大豆中的含量較低，目前缺少大豆皂苷相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，如果獲取或制備大豆皂苷則需要培育大豆皂苷含量高的專用品種，以及進(jìn)一步研究大豆皂苷提取，純化技術(shù)；2.目前大豆皂苷的檢測方法主要利用HPLC-MS聯(lián)用為主，但此儀器價格較為昂貴不利于推廣，可適當(dāng)選擇HPLC-ELSD手段進(jìn)行分析；3.大豆皂苷的檢測技術(shù)較為完善，但是在UPLC、免疫分析法的應(yīng)用較少，可對其分析方法進(jìn)行研究；因此首要任務(wù)是大豆皂苷的制備，及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的制備。加大高含量皂苷品種的培育以及大豆廢渣利用，或利用其他豆科植物獲取都是解決此問題的途徑。