多房棘球蚴蛋白TSP3的原核表達(dá)及分離純化#

刁曉艷，周 虎，李潤(rùn)樂(lè)，彭 海，李子安，湯 鋒*，楊全余**

( 1.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

泡型包蟲(chóng)病(Alveolar echinococcus)是一種多房棘球蚴感染引發(fā)的，危害極大的寄生蟲(chóng)病，手術(shù)和藥物治療為主要干預(yù)手段，但手術(shù)治療存在創(chuàng)傷大、術(shù)后易復(fù)發(fā)的弊端，而藥物治療存在品種相對(duì)單一、治療效果不理想的缺點(diǎn)[1]。疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)，療效確切，已經(jīng)成為防治疾病的重要手段。但研制疫苗需要尋找出有效而穩(wěn)定的抗原。

OkuY等人研究發(fā)現(xiàn)TSP3是在多房棘球蚴感染過(guò)程中產(chǎn)生的免疫原性最好的蟲(chóng)體蛋白[2-3]。本研究也是基于前人研究的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)信息與基因重組技術(shù)，獲得TSP3基因信息，構(gòu)建TSP3表達(dá)的質(zhì)粒載體，借助大腸桿菌的表達(dá)獲得目的蛋白TSP3。

1 材料與方法

1.1 材料

TOP10 菌株及質(zhì)粒pCzn1從南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司購(gòu)置；限制性內(nèi)切酶由TaKaRa公司提供；Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱由BIO-RAD公司提供；His抗體、羊抗兔抗體由ThermoFisher公司提供；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒由AXYGEN公司提供。

1.2 方法

1.2.1 TSP3的序列獲得

在GenBank程序中檢索TSP3的核苷酸序列及氨基酸序列顯示，TSP3含有堿基267 bp。對(duì)TSP3進(jìn)行基因合成(南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司)。如下所示，劃線部位即為TSP3基因序列。

GTGCACATTCCTTTAACGCTTCAAAATCTGTAA

AGCACGCCATATCGCCGAAAGGCACACTTAATTATT

AAGAGGTAATACACCATGAATCACAAAGTGCATCAT

CATCATCATCATATGCATGAATTCGTTGGTTTAGTTG

GTAAAGAAATGCAACGTGAAATTAAAGATCTGACCG

CACACGGCCGTAACGCAAGCGATCCCTTATTAAAAA

GCATTTACAAACTGCAAGAGGAACTTGAATGTTGTG

GGGGTGTGGGTCCGACAGACTGGAGCAAACCGTACC

CGGCCAGCTGTTGTAAATCAGGCAAAGAAAATTGTA

CGCAGCCGTATCAGCAGGGATGTGCAGTGGCAATGT

ATGAGCAGATTAAAGATAGCAGCCTGTAACTCGAGG

GATCCGAATTCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAGAT

AGGTAATCTCTGCTTAAAAGCACAGAATCTAAGATC

CCTGCCATTTGGCGGGGATTTTTTTATTTGTTTTCAGG

AAATAAATAATCGATCGCGTAATAAAATCTATTATT

ATTTTTGTGAAGAATAAATTTGGGTGCAATGAGAAT

GCGCAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGAC

GGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG

GTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGA

CAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGG

TGTCGGG

1.2.2 重組質(zhì)粒pCzn1-TSP3的測(cè)序

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)拼接引物，將重組質(zhì)粒pCzn1-TSP3轉(zhuǎn)入感受態(tài)的TOP10中，挑取陽(yáng)性單菌落測(cè)序(南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司)，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對(duì)，可見(jiàn)測(cè)序結(jié)果部分與預(yù)期序列完全一致。截取部分比對(duì)序列示意(圖1)。

圖1部分序列比對(duì)結(jié)果圖

Figure1Partialsequencealignmentresultsmap

2 質(zhì)粒酶切鑒定

2.1 酶切體系

質(zhì)粒3 μLNdeI0.25 μLXhoI0.25 μL10×Buffer1.0 μL DDWUp to 10 μL

pCzn1-TSP3經(jīng)酶切后，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2 酶切鑒定結(jié)果(圖2)

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在200 bp大小附近有濃聚的條帶，即與目的基因TSP3 267 bp的大小相吻合，見(jiàn)酶切鑒定結(jié)果(圖2)。

M：Marker；1：酶切前質(zhì)粒pCzn1-TSP3；2： 酶切后質(zhì)粒pCzn1-TSP3

圖2pCzn1-TSP3的酶切鑒定圖

Figure2IdentificationofplasmidspCzn1-TSP3byrestrictionendonucleaseanalysis

2.3 載體構(gòu)建示意圖

構(gòu)建的重組基因是基于pCzn1質(zhì)粒載體之上的基因序列，可以看出pCzn1質(zhì)粒本身具有Amp抗性(圖3)，這也為實(shí)驗(yàn)的下一步開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。

圖3pCzn1-TSP3質(zhì)粒載體構(gòu)建示意圖

Figure3ThestructureofplasmidpCzn1-TSP3

3 蛋白原核表達(dá)

3.1 TSP3的氨基酸信息

TSP3理論分子量為11.29 KD左右(含His-tag)，氨基酸序列如下：

MNHKVHHHHHHMHEFVGLVGKEMQREIKDLT

AHGRNASDPLLKSIYKLQEELECCGGVGPTDWSKPYP

ASCCKSGKENCTQPYQQGCAVAMYEQIKDSSL。

3.2 pCZN1-TSP3轉(zhuǎn)化及表達(dá)的過(guò)程

M：Maker；1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體蛋白；3：誘導(dǎo)破碎后的上清液；4：誘導(dǎo)破碎后的沉淀

圖4蛋白原核表達(dá)部位的SDS-PAGE鑒定效果圖

Figure4Expression，localizationandidentificationofproteinsTSP3bySDS-PAGE

3.3 TSP3蛋白的純化步驟

離心法收集誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌。將得到的細(xì)菌用PBS混懸離心，重復(fù)3次，以減少細(xì)菌中的培養(yǎng)上清液成分。后用PBS混懸細(xì)菌并在冰上行細(xì)胞破碎處理(20min)，離心(12000r/min，20min)后分別取上清液和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳明確目的蛋白TSP3表達(dá)的部位。

明確TSP3表達(dá)部位后，純化蛋白的主要步驟如下：蛋白溶液加入到經(jīng)Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱中；以Binding-Buffer流速?zèng)_洗(0.5mL/min)，至流出液OD280值達(dá)到基線；用Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)沖洗(流速1mL/min)，待OD280值達(dá)到基線；后經(jīng)Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)洗脫(流速1mL/min)，收集流出液即目的蛋白。將收集溶液加入透析袋中，在含有20 mm Tris-HCl、0.5 M NaCl的溶液中(pH8.0)進(jìn)行透析(12h)后，將溶液離心(12000r /min，20min)并收集上清液。用聚乙二醇20000(PEG20000)濃縮離心上清液。并進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析(圖5)。

M：Maker；1：破碎后的全菌蛋白；2：流出液；3：洗脫液

圖5目的蛋目TSP3的SDS-PAGE分析效果圖

Figure5PurityidentificationofproteinsTSP3bySDS-PAGE

3.4 TSP3的純化結(jié)果

本研究中，目的蛋白TSP3可以在大腸桿菌DE3中進(jìn)行表達(dá)，且以可溶性蛋白的形式存在該原核表達(dá)系統(tǒng)中。后對(duì)純化的目的蛋白TSP3行SDS-PAGE電泳，可見(jiàn)在11.29 KD處有一明顯增粗的條帶，其大小和TSP3理論值基本相符。本實(shí)驗(yàn)亦可證實(shí)，利用原核表達(dá)載體(大腸桿菌DE3)表達(dá)的TSP3經(jīng)純化后可達(dá)到電泳純級(jí)別。

4 目的蛋白鑒定

M：Maker；1：純化后樣品

圖6蛋白WesternBlot鑒定分析圖

Figure6WesternBlotanalysisoffusionproteinpurification

5 討論

大腸桿菌作為經(jīng)典的原核表達(dá)系統(tǒng)的代表，有著遺傳背景明了、培養(yǎng)程序簡(jiǎn)單、目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)化效率高、工程菌生長(zhǎng)繁殖快、易量產(chǎn)且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)[4-7]。生長(zhǎng)激素是第一個(gè)被大腸桿菌作為工程菌表達(dá)出的目的蛋白[8]，也標(biāo)志著原核表達(dá)技術(shù)的成熟。因此，本課題選擇大腸桿菌作為目的蛋白TSP3的原核表達(dá)工具，以實(shí)現(xiàn)TSP3蛋白的成功及高效表達(dá)。

目的蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)的工程菌中表達(dá)，由于工程菌種不同及培養(yǎng)的條件(溫度、OD600值、IPTG濃度等)不同，其表達(dá)目的蛋白的部位也有差異，可分為三種形式，即胞外分泌表達(dá)、周質(zhì)表達(dá)、胞質(zhì)表達(dá)。其中周質(zhì)表達(dá)即可溶性表達(dá)，其目的蛋白主要表達(dá)于周漿間隙中，其活性有無(wú)及大小主要受蛋白結(jié)構(gòu)、工程菌培養(yǎng)條件等影響[9-11]。由于具有獲取目的蛋白便捷，免除變性及復(fù)性等步驟的優(yōu)點(diǎn)，目前有許多研究是以促進(jìn)周質(zhì)蛋白的表達(dá)獲取目的蛋白[12-13]。包涵體蛋白相對(duì)于其他兩種形式蛋白具有產(chǎn)量大的優(yōu)點(diǎn)，但由于需要對(duì)目的蛋白進(jìn)行變性后復(fù)性的處理，其操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，但此技術(shù)也在不斷改良，便于蛋白回收[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)上述培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件下表達(dá)出的目的蛋白TSP3主要以周質(zhì)蛋白的形式予以表達(dá)，利于蛋白的分離及純化。

不同蛋白的物理性及化學(xué)性存在差異，主要表現(xiàn)在蛋白大小、溶解度、疏水性和生物學(xué)活性等方面，可以據(jù)此將不同蛋白加以分離純化[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中，分離后的菌體蛋白經(jīng)Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱進(jìn)行純化處理，也是利用了不同蛋白存在差異性的特點(diǎn)。

本研究在獲取多房棘球蚴抗原TSP3基因序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)行氨基酸序列的合成，經(jīng)與質(zhì)粒載體進(jìn)行重組，構(gòu)建適合原核表達(dá)的質(zhì)粒載體，并經(jīng)酶切、測(cè)序方法予以證實(shí)(重組成功)。后經(jīng)蛋白表達(dá)、表達(dá)部位鑒定、純化等方法，證實(shí)以pCzn1為載體的TSP3能在原核表達(dá)載體大腸桿菌DE3中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)目的蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中以周質(zhì)蛋白的形式表達(dá)，且可獲得電泳純蛋白，用于TSP3蛋白生物學(xué)活性及免疫學(xué)的后續(xù)相關(guān)研究。