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    藏藥久美2號對抗小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病的療效研究※

    2018-09-26 12:17:12洛桑達哇劉文磊楊寶良王海久久美彭措樊海寧
    關(guān)鍵詞:久美阿苯達唑藏藥

    洛桑達哇 ,劉文磊,楊寶良,湯 鋒,王海久,久美彭措,樊海寧*

    (1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科,青海 西寧 810001;2.青海省包蟲病研究重點實驗室,青海 西寧 810001;3.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心,青海 西寧 810001;4.青海省久美藏藥藥業(yè)有限公司 青海 西寧 810001)

    多房棘球蚴病(alveolar echinocococosis,AE)又稱泡型包蟲病,治療藥物主要為苯并咪唑衍生物,如阿苯達唑(ABZ)和甲苯咪唑,但這些藥物的主要作用是抗寄生蟲生長,而不是殺滅寄生蟲,同時有效率較低,長期應(yīng)用后還會產(chǎn)生嚴重的副作用[1]。因此,探索新藥物受到研究者的關(guān)注,也成為近年來的研究熱點。經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn),我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對棘球蚴病的發(fā)生、病理變化有著較深的認識,同時在實踐中總結(jié)了一些較為可靠的治療方法。國內(nèi)學(xué)者通過動物實驗研究證實了中藥消包粉、漢防己甲素在小鼠的抗棘球蚴病的治療中有一定的效果,且漢防己甲素與阿苯達唑聯(lián)用時能增強阿苯達唑的療效[2]。本實驗中所使用的藏藥久美2號屬于廣譜類驅(qū)蟲藥,其主要成分酸藤果、紫鉚子、天仙子等幾種藥材組成,用于治療鉤蟲、蛔蟲、鞭蟲、蟯蟲、施毛蟲等寄生蟲病,本實驗在體內(nèi)、體外水平研究并觀察藏藥久美2號對小鼠多房棘球蚴病的對抗作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    藏藥久美2號(青海久美藏藥藥業(yè)有限公司),RPMI-1640(Gibco公司),青霉素-鏈霉素混合溶液(Gibco公司),胎牛血清(Gibco公司)。振蕩混勻器(Thermo公司),超聲破碎儀(冠森生物公司),制冰機(上海析達儀器公司),BT224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器公司),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),恒溫箱(中國常州國華公司),純水制備器(Thermo公司),制冰機(上海析達儀器公司),BB150型培養(yǎng)箱(Thermo公司),Axio Vert.A1型光學(xué)顯微鏡(蔡司公司),微量加樣器(Eppdorf公司),細胞培養(yǎng)瓶(美國康寧公司)。

    SPF級BALB/c小鼠[7~8周齡,購于維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2012-0001]。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 藏藥久美2號在體外對小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴原頭蚴的作用觀察

    1.2.1.1 原頭蚴提取

    在已感染多房棘球蚴的小鼠(取自青海省包蟲病研究重點實驗室)腹腔內(nèi)取出感染病灶組織,用含雙抗的PBS溶液(60μg/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素)沖洗數(shù)次后,在含雙抗的PBS溶液中將病灶剪碎,然后將含病灶碎片的溶液進行兩次過濾(先后通過孔徑為150、30μm的聚酯紗),過濾后得到的沉淀即為原頭蚴[3],再用含雙抗的PBS沖洗三次后,若鏡檢活原頭蚴占90%左右即可進行體外培養(yǎng)。

    1.2.1.2 藥物處理

    將久美2號水提物溶于RPMI1640培養(yǎng)液中,通過超聲破碎法配制成溶液(160mg/mL)備用。實驗分為兩組,實驗組和對照組(未加入藥物的培養(yǎng)基)。其中實驗組分為高濃度組(16.0mg/mL)、中濃度組(8.0mg/mL)、低濃度組(1.6mg/mL)。

    1.2.1.3 原頭蚴的體外培養(yǎng)及活性測定

    在RPMI1640培養(yǎng)液中加入20%胎牛血清和雙抗(60μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)至終體積為40 mL,再將配好的培養(yǎng)基加入到已提取的原頭蚴中,使?jié)舛葹?1000~2000)個原頭蚴/mL,將所得原頭蚴溶液與濃度為160 mg/mL的藥物(高濃度組50μL,中濃度組25μL,低濃度組5μL)加入24孔板中,每孔0.5 mL,混勻后置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng),每天各組吸出一個孔(即0.5mL)中的混合溶液,用0.4%臺盼藍染液染色,3 min內(nèi)進行計數(shù)(鏡下觀察,死亡原頭蚴被染成藍色,未著色為活原頭蚴),每次計數(shù)原頭蚴約300個。

    1.2.2 藏藥久美2號在體內(nèi)對小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病的作用觀察

    1.2.2.1 小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病體內(nèi)模型建立

    將已感染多房棘球蚴的小鼠處死后,放置于75%酒精中浸泡60 s,取出后立即用無菌紗布擦拭干凈,并放置于無菌操作臺中,用已滅菌的鑷子和剪刀在小鼠腹腔中取出多房棘球蚴的病灶組織,放置于已加入青霉素(60μg/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的PBS緩沖液中,用已滅菌的眼科剪剪碎,制成原頭蚴濃度為3000個/mL的懸液,然后取32只健康小鼠,經(jīng)腹腔注射已配好的等濃度的原頭蚴懸液(0.2mL/只)。

    1.2.2.2 治療劑量計算及藥物處理

    取人用藥劑量的12倍作為小鼠的治療劑量。將藏藥久美2號(0.6g/kg·d)、阿苯達唑(0.24g/kg·d)兩種藥物與無菌純水充分混合后進行超聲破碎。

    1.2.2.3 藥物治療

    將32只小鼠分成四組,每組8只,分別為久美2號組、阿苯達唑組、模型對照組及空白對照組。用小鼠灌胃針以0.15 mL/10 g·d的劑量對各組小鼠進行灌胃治療,連續(xù)90 d。

    1.2.2.4 藏藥久美2號和阿苯達唑連續(xù)用藥90 d后對小鼠多房棘球蚴病灶組織濕重和病灶囊重抑制率的計算

    通過眼球取血法收取小鼠血液,完畢后處死小鼠并放置于75%酒精中,浸泡約1 min,待取出小鼠后立即用無菌紗布擦拭干凈,置于無菌操作臺中。直視下剖開小鼠腹腔,游離并取多房棘球蚴組織, 測定病灶組織的重量, 計算小鼠多房棘球蚴的囊重抑制率[多房棘球蚴囊重抑制率(%)=(對照組多房棘球蚴囊重-治療組多房棘球蚴囊重)/對照組泡球蚴囊重×100 %]。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 久美2號在體外對小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病原頭蚴的作用觀察

    三組不同時間原頭蚴死亡率的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),組別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),時間與組別的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

    組間分析,第1、3、6 d時,三組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);第12 d時,三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),進一步做兩兩比較可知,16.0 mg/mL組高于其他三組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),8.0 mg/mL組高于對照組和1.6 mg/mL組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),對照組和1.6 mg/mL組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第18 d時,三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),進一步做兩兩比較可知,對照組明顯低于其他三組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),16.0 mg/mL組和8.0 mg/mL組明顯高于1.6 mg/mL組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),16.0 mg/mL組和8.0 mg/mL組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    組內(nèi)分析,對照組與16.0 mg/mL組、8.0 mg/mL組、1.6 mg/mL組不同時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。進一步做兩兩比較可知,對照組表現(xiàn)為第1 d明顯低于第3、6、12、18 d(P<0.05),第3 d明顯低于第12 d和第18 d(P<0.05),其他兩兩時點間差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);16.0 mg/mL組、8.0 mg/mL組、1.6 mg/mL組均表現(xiàn)為第18 d>第12 d>第3 d和第6 d>第1 d,差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),第3 d和第6 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    組別n第1 d第3 d第6 d第12 d第18 dFP對照組312.33±2.8921.33±2.52a25.67±1.53a29.67±2.52ab34.00±5.00ab24.8680.008久美2號(16mg/mL)組312.33±2.8928.33±2.08a29.33±3.51a50.67±3.51abcA66.67±2.89abcdA121.080<0.001久美2號(8mg/mL)組312.33±2.8926.67±4.73a28.67±1.53a42.67±1.53abcAB57.67±7.23abcdA54.5190.016久美2號(1.6mg/mL)組312.33±2.8925.67±1.53a27.00±5.29a33.67±1.53abcBC48.33±3.51abcdABC48.0500.008F <0.001 3.031 0.731 45.429 23.846 - -P 1.000 0.093 0.562 <0.001 <0.001 - -

    a:與第1 d比較,P<0.05;b:與第3 d比較,P<0.05;c:與第12 d比較,P<0.05;d:與第12 d比較,P<0.05;A:與對照組比較,P<0.05;B:與16.0 mg/mL組比較,P<0.05;C:與8.0 mg/mL組比較,P<0.05。

    圖1 培養(yǎng)18d期間對照組與不同濃度藥物組原頭蚴死亡率的比較圖

    A:對照組3 d后觀察結(jié)果;B:8.0 mg/mL組干預(yù)3 d后觀察結(jié)果;C:16.0 mg/mL組干預(yù)6 d后觀察結(jié)果;D:1.6 mg/mL組干預(yù)12 d后觀察結(jié)果;E:8.0 mg/mL組干預(yù)12 d后觀察結(jié)果;F:16.0 mg/mL組干預(yù)12 d后觀察結(jié)果;G:對照組18 d后觀察結(jié)果;H:8.0 mg/mL組干預(yù)18 d后觀察結(jié)果;I:16.0 mg/mL組干預(yù)18 d后觀察結(jié)果。圖中→ 表示失去正常形態(tài)的原頭蚴。

    圖2光鏡下不同濃度藥物干預(yù)后原頭蚴的形態(tài)圖(40×)

    Figure2MorphologicalmapoftheProtoscolexofechinococcusmultilocularisafterinterventionwithdifferentconcentrationsunderlightmicroscope(40×)

    圖2為光鏡下不同濃度藥物干預(yù)組原頭蚴的形態(tài),A圖可以看到正常原頭蚴形態(tài)(活動正常,胞體飽滿,被摸完整,頂突存在,鉤體結(jié)構(gòu)正常,微毛排列整齊);8.0 mg/mL組干預(yù)3 d后(B圖)原頭節(jié)胞體皺縮數(shù)量明顯增多;16.0 mg /mL組干預(yù)6 d(C圖)、1.6 mg/mL組干預(yù)12 d(D圖)、8.0 mg/mL組干預(yù)12 d后(E圖)原頭蚴胞體皺縮數(shù)量明顯增多的同時,死亡率也較對照組有明顯差異;16.0 mg/mL組干預(yù)12 d后(F圖)除了原頭蚴死亡數(shù)量增多、胞體皺縮增多外,還可看到大量的鈣粒漏出;在16.0 mg/mL組干預(yù)18 d后(I圖)其視野內(nèi)已經(jīng)看不到正常形態(tài)的原頭蚴,除之前觀察的結(jié)果外,還發(fā)現(xiàn)有大量的胞體碎片和鈣小體,頂突上的鉤體排列紊亂,基本脫落,微毛排列紊亂,其中少量原頭蚴雖失去了正常原頭蚴形態(tài),但在臺盼藍染色過程中拒染,所以未被視作死亡原頭蚴。

    2.2 久美2號在體內(nèi)對小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病的作用觀察

    久美2號和阿苯達唑連續(xù)用藥90 d后小鼠多房棘球蚴病灶組織濕重和病灶囊重抑制率的計算結(jié)果如表2~3所示。久美2號組和阿苯達唑組連續(xù)用藥90 d后與模型對照組相比較:在小鼠體內(nèi)多房棘球蚴病灶組織濕重的數(shù)值上的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義,而且其中久美2號組和模型對照組相比差異存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0039,P<0.01),阿苯達唑組與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0164,P<0.05),久美2號組與阿苯達唑組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2053);在小鼠多房棘球蚴病灶囊重抑制率方面,久美2號組和阿苯達唑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2103);三組多房棘球蚴濕重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),進一步做兩兩比較可知,藏藥久美2號組、阿苯達唑組明顯低于模型對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),藏藥久美2號組與阿苯達唑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    Table 2Comparison of wet weights of three groups of

    *:與久美2號組比較,P<0.05;#:與阿苯達唑組比較,P<0.05。

    藏藥久美2號組、阿苯達唑組分別有4例、3例抑制,抑制率分別為57.1%和42.9%,兩組抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表3兩組囊重抑制率比較結(jié)果[n(%)]

    Table 3Comparison of cystic weight inhibition rates in two groups[n(%)]

    3 討論

    AE是多房棘球蚴所致的一種嚴重的人畜共患寄生蟲病。高發(fā)于青海省三江源和四川交界地域,其具有發(fā)病范圍廣、惡性程度高、預(yù)后效果差的特點。目前用于治療AE的有效藥物很少,主要為甲苯咪唑、阿苯達唑,但因其溶解性差,腸道吸收率及生物利用度低,療效不穩(wěn)定,治療效果不盡人意。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,很多研究者做了一些這方面的探索,王軼等人[4]研究發(fā)現(xiàn),川穹嗪聯(lián)合阿苯達唑治療小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病,發(fā)現(xiàn)對多房棘球蚴有明顯的抑制效果,而且兩者聯(lián)合使用比單獨使用效果更佳,證明兩者間有協(xié)同治療作用。李小娟[5]研究發(fā)現(xiàn),蒿甲醚在體外也對多房棘球蚴原頭蚴有一定的破壞作用;陳根等人[6]研究發(fā)現(xiàn),漢防己甲素和阿苯達唑可單獨或聯(lián)合用藥于小鼠繼發(fā)性泡球蚴病,在聯(lián)合使用的時候,漢防己甲素能有效增強阿苯達唑的效果,兩者具有一定的協(xié)同作用;張睿等人[7]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿對小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病有一定的治療作用,并能增強阿苯達唑?qū)π∈罄^發(fā)性多房棘球蚴病的療效。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯聯(lián)合阿苯達唑脂質(zhì)體抑制包蟲的復(fù)發(fā)作用不佳[8]。

    本研究首次從體內(nèi)、體外綜合水平驗證了藏藥久美2號對抗多房棘球蚴及原頭蚴生長的抑制作用,證明此藥物對多房棘球蚴病有一定的療效,并且在體內(nèi)對小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴的抑制作用明顯優(yōu)于阿苯達唑。由于實驗經(jīng)費有限,未能以電鏡下所觀察結(jié)果來進一步驗證此藏藥對原頭蚴的作用。未來我們將進一步完善實驗,證明此藥對多房棘球蚴病具有療效的同時,對其可能的作用機制進行深入探討。

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