翹鱗香菇菌絲體多糖的分離純化、抗氧化及體外抗腫瘤活性研究

陳艷娟 盧文露 張玉英 伍 燕

（興義民族師范學(xué)院， 貴州 興義 562400）

翹鱗香菇（Lentunussquarrosulus）屬真菌界、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、多孔菌科、香菇屬[1]，春末夏秋子實體群生、叢生或疊生于腐木及倒伏木樁上[2]，在我國主要分布于貴州、云南、四川、海南等地。翹鱗香菇可食用，老百姓俗稱“八擔(dān)柴”，在國內(nèi)已可人工馴化栽培[3]，是一種食用兼藥用型真菌，其提取物具有抑菌作用[4]、免疫調(diào)節(jié)作用[5]、抗氧化作用[6]及潛在的抑制腫瘤功效[8]。

近年來研究表明，真菌多糖是一種優(yōu)良的免疫抑制劑[10]，從香菇子實體中提取的香菇多糖（lentinan），在臨床上已作為抗腫瘤抑制藥物使用[11]，與香菇同屬的翹鱗香菇在許多理化活性上也表現(xiàn)良好。本實驗通過水煮醇沉得到粗多糖，進一步通過纖維凝膠柱分離純化，得到翹鱗香菇精制多糖。采用紅外對精制多糖的糖類特征吸收譜進行了研究，比較了粗多糖和精制多糖的抗氧化活性，并對精制多糖的體外抗腫瘤活性進行了初步研究，為進一步對該翹鱗香菇多糖的產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

翹鱗香菇子實體采自貴州省冊亨縣，菌絲分離得到純培養(yǎng)物保存于興義民族師范學(xué)院微生物實驗室[12]。氯化717陰離子交換樹脂，索萊寶公司；DEAE-纖維素52，Sephadex G-100，上海瑞永生物科技公司；3500Mw透析袋，美國sigma公司；磷酸二氫鈉、鹽酸、硫酸、蒽酮、無水乙醇、氫氧化鈉、葡萄糖：分析純國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

（二）儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52-2型，上海亞榮生化儀器公司；恒溫水浴鍋HH-2型，江蘇省金壇市新航儀器廠；真空冷凍干燥機LGJ-10，北京松源華興科技有限公司；VERTEX 70傅里葉變換顯微紅外/拉曼光譜儀（德國Bruker公司）；紫外分光光度儀Cary-60，安捷倫科技有限公司；Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國賽默飛公司。

（三）方法

1.翹鱗香菇菌絲多糖的提取、分離與純化

翹鱗香菇菌絲以10%的接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，靜置培養(yǎng)20天，取出烘干后磨成粉待用。取5g干菌粉以料液比1:20的比例加入蒸餾水，沸水提取2h，收集提取液，重復(fù)一次。在提取液中加入無水乙醇，終濃度調(diào)整到75%，4℃冰箱過夜沉淀，離心、棄上清得粗多糖，干燥后復(fù)溶于水；采用717陰離子交換樹脂脫色，sevage脫蛋白，粗多糖溶液過DEAE-纖維素52柱分離，用不同濃度的 NaCl溶液（0.05、0.1、0.2、0.3mol/L）洗脫，Sephadex G-100柱進一步純化，收集多糖組分，透析除鹽后冷凍干燥，得到精制翹鱗香菇多糖[13]。蒽酮硫酸法測多糖含量[14]。

2.紫外、紅外光譜分析

溶解適量的多糖樣品，全波長掃描（掃描范圍200～800nm）；稱取干燥的精制多糖樣品1mg與50mg干燥的KBr晶體混勻研磨后壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析（掃描范圍400～4000cm-1）。

3.抗氧化活性實驗

還原力測定[15]：配制粗多糖和精制多糖不同濃度樣液 0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5mg/mL，取 1.5mL EP管6支，依次加入250μL的磷酸緩沖液(0.2M,pH6.6)，不同濃度樣液100μL(ddH2O作空白對照)，1%（m/m）鐵氰化鉀 250μL，混勻后 50℃水浴20min，加入10%（m/m）三氯乙酸溶液250 μL終止反應(yīng)，混勻取各樣品上清液250μL于新的各EP 管中，加入 0.1%（m/m）氯化鐵 250μL，靜置10min，取200μL于96孔板中，在700nm處用酶標(biāo)儀測定其吸光度，記為Ai；同時做空白處理，用ddH2O代替樣品，本底吸光記為Aj，以Vc為陽性對照。重復(fù)3次，總還原力=Ai-Aj。

DPPH自由基清除測定[16]：配制粗多糖和精制多糖不同濃度樣液 0.04、0.08、0.2、0.4、0.6、0.8 和1mg/mL，各取不同濃度樣液100μL加入0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液300μL，混勻后避光放置30min，取200μL在517nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，記為A1；另取不同濃度樣液100μL加入無水乙醇300μL，同法測定吸光度，記為A2；另取ddH2O 100μL加入DPPH乙醇溶液300μL，測定吸光度記為A0；以Vc為陽性對照。重復(fù)3次，DPPH 清除率 =[1-（A1-A2）/A0]×100%。

羥自由基清除測定[17]：配制粗多糖和精制多糖不同濃度樣液 0.4、0.8、1.2、1.6、1.8 和 2.0mg/mL，取不同濃度樣液100μL，依次加入9.0mmol/L水楊酸乙醇溶液 100μL、9.0mmol/L FeSO4溶液100μL、8.8mmol/L H2O2溶液 100μL啟動反應(yīng)，混勻后 37℃水浴30min，取200μL各樣液在510nm波長處測定吸光度，記為Ai；另取試管以ddH2O代替樣液，同法加入上述藥品，同法測定，記為A0；另取試管以ddH2O代替樣液和H2O2，測定吸光度，記為Aj；以Vc為陽性對照。重復(fù)三次，·OH 清除率 =[A0-（Ai-Aj）]/A0×100%。

4.MTT法抑制HELA腫瘤細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期的HELA細胞[18]，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105/mL。接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細胞懸液100μL（1×104個細胞）。實驗設(shè)陰性對照組（含10%胎牛血清DEME培養(yǎng)液），翹鱗香菇多糖各濃度 （1200、600、300、150、75μg/mL）， 陽 性 對 照（5-FU），共7組，每組設(shè)5個重復(fù)孔。培養(yǎng)置37℃、5%CO2和95%濕度條件下24h，每孔加入5 mg/mL的MTT磷酸緩沖液20μL，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，待形成的甲臜顆粒溶解后，酶標(biāo)儀490nm波長測定吸光度，按公式計算細胞生長抑制率：抑制率=1-實驗孔A490平均值/對照空A490平均值。

5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel2016處理洗脫曲線和抗氧化數(shù)據(jù)、origin 8.0處理紅外數(shù)據(jù)、GraphPad-Prism-5處理IC50值。

二、結(jié)果與分析

（一）翹鱗香菇菌絲體多糖的分離純化

如圖1所示，粗多糖過DEAE-52柱，以不同濃度NaCl洗脫后收集得到組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ，三個組分的多糖洗脫液分別經(jīng)3500Mw透析、冷凍干燥后，從組分Ⅲ得到白色晶體的精制多糖，組分Ⅰ和組分Ⅱ未收集到多糖。取10mg組分Ⅲ多糖復(fù)溶于2mL的ddH2O中，0.05mol/L的NaCl溶液作洗脫液過Sephadex G-100柱，收集吸光度較高的組分，透析凍干后得到精制翹鱗香菇多糖，經(jīng)0.1%蒽酮硫酸法檢測純度為96.6%。

圖1 翹鱗香菇菌絲體多糖通過DEAE-52柱洗脫曲線>Figure 1 Elution curve of L.squarrosulusmycelium polysaccharide on DEAE-52

（二）翹鱗香菇菌絲體精制多糖的紫外、紅外分析

圖2 翹鱗香菇多糖的紅外光譜圖Figure 2 FT-IR spectrum of purified L.squarrosulus polysaccharide

精制多糖紫外掃描，在260nm和280nm處無吸收峰，沒有核酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)；傅里葉紅外掃描如圖2所示，3400cm-1處是多糖分子中O-H的伸縮振動引起的吸收峰；2930cm-1處是多糖中C-H或亞甲基伸縮振動峰；1640cm-1處為羰基伸縮振動；1370cm-1處是多糖類 C-H的變角振動；1030cm-1信號峰是C-O-H和吡喃糖環(huán)C-O-C中C-O鍵伸縮振動引起的。此外，840cm-1是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷鍵連接特征吸收峰。由圖譜分析可知，翹鱗香菇多糖為β-型葡聚糖構(gòu)型[19]。

（三）翹鱗香菇精制多糖的抗氧化活性

圖3 翹鱗香菇精制多糖還原能力Figure 3 Reducing power of polysaccharides of L.squarrosulus

還原能力廣泛用于評價抗氧化能力的大小，由圖3可知，所測吸光度值越大，表明還原能力越強，翹鱗香菇菌絲粗多糖和精制多糖的還原力隨均隨多糖濃度的升高而升高，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，粗多糖的吸光度值是0.488±0.01，精制多糖的吸光度值為0.414±0.03，表明粗多糖和精制多糖在總還原力上有區(qū)別。

圖4 翹鱗香菇多糖DPPH自由基清除能力Figure 4 DPPH radical scavenging activity of polysaccharides of L.squarrosulus

翹鱗香菇菌絲提取多糖對DPPH·的清除作用見圖4，粗多糖清除率EC50值是0.394mg/mL，精制多糖清除率EC50值是0.54mg/mL，兩者的清除率與質(zhì)量濃度都有量效關(guān)系，粗多糖的EC50值小于精制多糖的EC50值，翹鱗香菇粗多糖對DPPH·的清除率方面優(yōu)于精制多糖，質(zhì)量濃度達到1.0mg/mL后清除率達到80%左右，抗氧化活性表現(xiàn)良好。

圖5 翹鱗香菇多糖羥自由基清除能力（Figure 5 Hydroxylradicalscavenging activity of polysaccharides of L.squarrosulus）

由圖5可知，翹鱗香菇菌絲體粗多糖、精制多糖和Vc羥自由基清除力與濃度均呈量效關(guān)系，粗多糖清除率EC50值是1.20mg/mL，精制多糖清除率EC50值是1.42mg/mL，隨著濃度增大到2.5 mg/mL時與Vc的清除率相差不大，說明翹鱗香菇多糖具有略低于Vc的羥自由基清除力。

（四）翹鱗香菇菌絲體多糖抑制HELA腫瘤細胞增殖實驗

由表1可知，在翹鱗香菇多糖濃度在75～1200μg/mL范圍內(nèi)，與陰性組和5-Fu陽性組相比，翹鱗香菇對HELA細胞具有顯著抑制作用，并隨濃度的增加，細胞的生長抑制率也隨之升高，呈明顯量效關(guān)系，IC50值用數(shù)據(jù)軟件 Graph-Pad-Prism-5計算得712μg/mL。

表1 翹鱗香菇多糖對HELA細胞生長抑制作用Table 1 Inhibitory effect of polysaccharides of L.squarrosuluson growth of HELA rumor cells（X±S，n=5）

三、討論

本研究對深層發(fā)酵后的翹鱗香菇菌絲體進行粗多糖和精制多糖的提取，采用蒽酮硫酸法定量、紅外和紫外定性，研究表明進一步純化后的多糖為高純度均一多糖，其紅外特征譜顯示是β-型葡聚糖構(gòu)型為主。據(jù)文獻報道[10]，具有分支側(cè)鏈的β-吡喃葡聚糖是抗腫瘤活性的主要物質(zhì)。

翹鱗香菇粗多糖和精制多糖抗氧化實驗比較表明，精制多糖在總還原力、DPPH·和·OH清除率方面沒有粗多糖活性高，可能是sevage除蛋白過程中損失了部分有抗氧化活性的糖蛋白，或是透析過程除掉了一些可能具有相關(guān)活性的小分子。粗多糖成分復(fù)雜，精制多糖是均一多糖，故對精制多糖的提取和活性研究對深入了解其機理具有重要作用。

對HELA細胞的抑制實驗表明，翹鱗香菇的菌絲體多糖具有良好的抗腫瘤活性，和李石軍等人[18]研究香菇多糖LNT2對H22腫瘤細胞抑制比較，翹鱗香菇在抑制腫瘤細胞生長方面表現(xiàn)出來的活性和香菇多糖LNT2類似，都具有良好的抑制腫瘤細胞活性的能力。另一方面，據(jù)Bussaman等人[20]研究表明，翹鱗香菇菌絲培養(yǎng)特性良好，長勢快，對翹鱗香菇子實體和菌絲體活性成分的分離純化，可為深入了解其藥理活性，為開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展開提供理論依據(jù)。