RANK/RANKL/OPG在角化囊性瘤、含牙囊腫、單囊型成釉細(xì)胞瘤囊壁上皮層表達(dá)的比較

陳凱瑞 羅春媛 裴婧 賈云香 譚艷林 楊莉 張強(qiáng)

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科（南昌330006）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣州口腔疾病研究所，口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510140）；3南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔病理科（南昌 330006）

頜骨囊性病變具有誘導(dǎo)局部骨吸收的能力，臨床及基礎(chǔ)研究表明頜骨囊性病變中囊液的流體壓力及滲透壓增高對周圍骨組織造成物理性壓迫而導(dǎo)致骨吸收［1]。隨著對骨代謝的認(rèn)識加深，更多學(xué)者意識到頜骨囊性病變的局部骨吸收能力及侵襲性可能取決于病變細(xì)胞活化破骨細(xì)胞的能力［2]。目前已經(jīng)明確的與骨吸收調(diào)控的相關(guān)因子較多，例如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等，通過影響RANK（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）、RANKL（receptor activator of nuclear factor-κBligand）、OPG（osteoprotegerin，OPG）的信號通路的表達(dá)從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及功能［3-4]。

口腔頜面部常見的成釉細(xì)胞瘤、角化囊性的臨床表現(xiàn)為良性但存在局部侵襲性行為，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。通常影像學(xué)上角化囊性瘤顯示為具有光滑或扇形邊界的透射影，而成釉細(xì)胞瘤表現(xiàn)為單囊或蜂窩狀多囊并常伴有根尖吸收。影像學(xué)表現(xiàn)的差異可以反映疾病中的RANK，RANKL和OPG含量的變化，并且很可能與病變處于活動或非活動階段相關(guān)。關(guān)于RANKL在成釉細(xì)胞瘤、含牙囊腫、根尖囊腫中的表達(dá)已有相關(guān)研究證實(shí)［5-6]，但是在單囊型成釉細(xì)胞瘤、角化囊性瘤、含牙囊腫等常見頜骨囊性病變中關(guān)于RANK/RANKL/OPG表達(dá)水平的比較目前研究較少。

本研究的目的是通過研究RANK、RANKL及OPG在口腔粘膜、含牙囊腫、角化囊性瘤、單囊型成釉細(xì)胞瘤等頜骨常見囊性病變囊壁上皮層的表達(dá)，比較疾病中各RANK信號通路分子表達(dá)水平。通過將RANK/RANKL/OPG的表達(dá)差異與疾病的影像學(xué)及臨床特點(diǎn)相聯(lián)系，闡述頜骨囊性病變骨內(nèi)生長可能的局部因素。

1 材料與方法

1.1 材料選擇2005年1月至2012年12月所有在南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院住院手術(shù)治療并且病理科明確診斷的無感染的含牙囊腫26例、單囊型成釉細(xì)胞瘤20例、角化囊性瘤23例，并且以10例口腔黏膜組織為對照組。術(shù)后病理診斷均由2名有經(jīng)驗(yàn)的口腔病理醫(yī)師做出，并在本次實(shí)驗(yàn)前再次明確。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本獲取及切片從病理科存檔的石蠟標(biāo)本中收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例，對照組：正常口腔黏膜標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP法RANK/RANKL/OPG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）最佳稀釋濃度分別是1∶200、1∶200、1∶150。按照常規(guī)操作，所有切片染色前均經(jīng)抗原修復(fù)。高壓熱修復(fù)抗原：將檸檬酸鹽緩沖液（PBS）加熱后，將切片置于鋼架上，后加入沸騰的PBS，然后將高壓鍋蓋緊閉，大火繼續(xù)加熱，10 min鐘后排氣繼續(xù)加熱5 min，隨后冷卻至室溫：PBS液清洗2次，每次5 min。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定采用10×40光學(xué)顯微鏡對所有切片組織上皮顯色反應(yīng)進(jìn)行觀察，并根據(jù)Barnes綜合計(jì)分法對切片進(jìn)行計(jì)分定性分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)：切片高倍鏡（400×）隨機(jī)取5個上皮視野，應(yīng)用A×B評分等級區(qū)分表達(dá)強(qiáng)度。A：顯色細(xì)胞的有無及深淺，不著色或與背景色相似、淺黃色，棕黃色或棕褐色分表記為1、2、3；B：顯色細(xì)胞的比例，1%～10%記為1、11%～50%記為2、51%～80%記為3、＞80%記為4；評分用A×B，0表示陰性表達(dá)（-）、1～4標(biāo)記為弱陽性表達(dá)（+）、＞4代表強(qiáng)陽性表達(dá)（++）。所有閱片均采用雙盲法。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，RANK、RANKL、OPG在各組之間表達(dá)水平的比較采用多個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test），兩兩比較采用R×C的Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RANK、RANKL、OPG在實(shí)驗(yàn)組及對照組中的表達(dá)情況見表1及圖（1～4）。光鏡下，RANK、RANKL、OPG等物質(zhì)被染色成黃色至棕褐色粗細(xì)不一顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在實(shí)驗(yàn)樣本中均有表達(dá)。在疾病組和黏膜中都有RANK蛋白表達(dá)，且單囊型成釉細(xì)胞瘤中陽性率高達(dá)85%，各疾病組的強(qiáng)陽性率高于正常黏膜（P＞0.05）。RANKL在牙源性角化囊性瘤中表達(dá)的陽性率最高，且角化囊性瘤、含牙囊腫，成釉細(xì)胞瘤切片中RANKL的表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05），3組疾病的RANKL的表達(dá)強(qiáng)度不存在差異。OPG蛋白在疾病組中水平表達(dá)較低，角化囊性瘤的表達(dá)強(qiáng)度高于成釉細(xì)胞瘤（P＜0.05），兩兩分析認(rèn)為OPG表達(dá)強(qiáng)度存在：黏膜＞角化囊性瘤＞成釉細(xì)胞瘤。

表1 RANK、RANKL、OPG在單囊型成釉細(xì)胞瘤、角化囊性瘤、含牙囊腫以及黏膜中的表達(dá)情況Tab.1 Distribution of cases with respect to RANK，RANKL，OPGranks of positive and negative in unicystic ameloblastomas，keratocystic odontogenic tumors，dentigerous cysts and mucosa

3 討論

圖1 RANK、RANKL、OPG在單囊型成釉細(xì)胞瘤（A、B、C）中的陽性表達(dá)（免疫組化染色，放大倍數(shù)×400）Fig.1 Representative immunohistochemical reactivity for RANK，RANKL，and OPGin the epithelium of unicystic ameloblastomas（A，B and C）（immunohistochemical staining，original magnification 400）

圖2 RANK、RANKL、OPG在角化囊性瘤（D、E、F）中的陽性表達(dá)（免疫組化染色，放大倍數(shù)× 400）Fig.2 Representative immunohistochemical reactivity for RANK，RANKL，and OPGin the epithelium of keratocystic odontogenic tumors（D，Eand F）（immunohistochemical staining，original magnification 400）

圖3 RANK、RANKL、OPG在含牙囊腫（G、H、I）中的陽性表達(dá)（免疫組化染色，放大倍數(shù)× 400）Fig.3 Representative immunohistochemical reactivity for RANK，RANKL，and OPGin the epithelium of dentigerous cysts（G，H and I）（immunohistochemical staining，original magnification 400）

圖4 RANK、RANKL、OPG在正常黏膜（J、K、L）中的陽性表達(dá)（免疫組化染色，放大倍數(shù)× 400）Fig.4 Representative immunohistochemical reactivity for RANK，RANKL，and OPGin the epitheliumof normal mucosa（J，K and L）（immunohistochemical staining，original magnification 400）

該研究應(yīng)用免疫組化方法檢測RANK、RANKL、OPG等因子在單囊型成釉細(xì)胞瘤，角化囊性瘤和含牙囊腫的囊壁上皮層表達(dá)，并以10例口腔黏膜為對照組。以往的研究顯示RANK/RANKL/OPG信號通路的活化在牙源性腫瘤及非腫瘤疾病造成頜骨吸收過程中有重要意義［5-7]，然而單囊型成釉細(xì)胞瘤、角化囊性瘤、含牙囊腫等常見頜骨囊性病變中關(guān)于RANK/RANKL/OPG表達(dá)水平的比較目前研究較少。

成釉細(xì)胞瘤是經(jīng)典的良性牙源性腫瘤，其生長具有局部侵襲性、手術(shù)治療后有較高的復(fù)發(fā)率［8]。單囊型成釉細(xì)胞瘤的性質(zhì)類似于牙源性囊腫，X線多呈現(xiàn)邊緣清晰的單房性透射影且病損區(qū)域常含有阻生的牙齒，需要與角化囊性瘤、含牙囊腫等鑒別。病例回顧研究發(fā)現(xiàn)青年患者中成釉細(xì)胞瘤多見單囊型成釉細(xì)胞瘤，臨床上保守治療常有較高的復(fù)發(fā)率，其復(fù)發(fā)率范圍從16%～30.5%不等［9]。與其性質(zhì)類似的頜骨角化囊性瘤的發(fā)病年齡集中在10～29歲，影像學(xué)上角化囊性瘤多呈單囊或多囊性橢圓形投射影，邊緣清晰并常伴有邊緣骨質(zhì)硬化。臨床上多采取保守手術(shù)治療但是復(fù)發(fā)率高達(dá)20%～30%，甚至角化囊性瘤有癌變的零星文獻(xiàn)報(bào)道［10]?；趩文倚统捎约?xì)胞瘤與角化囊性瘤的臨床行為和影像學(xué)特點(diǎn)，RANK、RANKL、OPG的表達(dá)水平在兩組疾病囊壁上皮中可能存在差異。關(guān)于成釉細(xì)胞瘤破骨機(jī)制的研究中顯示“成釉細(xì)胞瘤骨吸收與瘤細(xì)胞中OPG低表達(dá)和RANKL高表達(dá)相關(guān)”［11]。研究中也觀察到RANKL、RANK及OPG在單囊型成釉細(xì)胞瘤及角化囊性瘤的囊壁上皮結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，較正常粘膜組織上皮結(jié)構(gòu)存在RANKL和RANK高表達(dá)，OPG低表達(dá)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)單囊型成釉細(xì)胞瘤和角化囊性瘤的囊壁上皮結(jié)構(gòu)中的RANKL陽性表達(dá)率不存在差異（P＞0.05），然而OPG的表達(dá)水平則表現(xiàn)單囊型成釉細(xì)胞瘤的表達(dá)水平低于角化囊性瘤（P＜0.05），即單囊型成釉細(xì)胞瘤較角化囊性瘤有更強(qiáng)的骨吸收破壞能力。病變組織高表達(dá)RANKL和低表達(dá)OPG導(dǎo)致鄰近的骨組織中破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，因而我們認(rèn)為臨床上單囊型成釉細(xì)胞瘤較角化囊性瘤存在較大骨破壞性及復(fù)發(fā)率可能與OPG表達(dá)水平差異有關(guān)。該研究結(jié)果與大部分研究結(jié)論一致［12-13]，但是部分學(xué)者的研究的結(jié)論也值得思考，特別是KUMAMOTO和OOYA的研究中觀察到的成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞中有這較高的OPG 的表達(dá)［14]。

含牙囊腫又稱濾泡囊腫，指囊壁包含一個未萌牙的牙冠并附著于該牙的頸部的囊腫。因此其存在典型的X表現(xiàn)圓形透射區(qū)，邊界清晰，囊腔內(nèi)含有一個未萌的牙冠，較大的病變可呈多房性改變。但是囊腔含有牙齒的特點(diǎn)并非其獨(dú)有，角化囊性瘤，單囊型成釉細(xì)胞瘤囊腔中也多見含有未萌出的牙齒。含牙囊腫多見于10～39歲男性并且手術(shù)治療后很少復(fù)發(fā)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含牙囊腫囊壁上皮結(jié)構(gòu)中OPG表達(dá)水平與正常黏膜中的接近，但是RANKL表達(dá)水平正常黏膜的高，并且與角化囊性瘤、單囊型成釉細(xì)胞瘤之間不存在差異。含牙囊腫造成頜骨吸收的機(jī)制可能與囊壁上皮細(xì)胞高表達(dá)RANKL信號分子，激活的RANKL信號通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞凋亡，最終頜骨吸收形成。對比含牙囊腫、角化囊腫和單囊型成釉細(xì)胞瘤中OPG的表達(dá)強(qiáng)度，有理由認(rèn)為含牙囊腫的預(yù)后良好與OPG高表達(dá)相關(guān)。最后也應(yīng)該注意到RANK的表達(dá)水平在各組切樣本中的表達(dá)水平不存在差異，這表明在3種頜骨囊性病變中RANK所起的作用有限，可能RANK并不是RANK/RANKL/OPG信號通路的主導(dǎo)者。同時(shí)頜骨的代謝涉及眾多的信號分子，RANK信號通路僅是其中較關(guān)鍵的一部分而且其作用不僅僅只有骨代謝相關(guān)。

研究中可以觀察到RANK、RANKL、OPG信號分子在正常黏膜、含牙囊腫、角化囊性瘤及單囊型成釉細(xì)胞瘤的上皮結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，顯示牙源性腫瘤與非腫瘤類疾病都能夠表達(dá)RANK信號通路分子，擴(kuò)展了關(guān)于RANK信號通路的知識。然而用免疫組化方法探討單囊型成釉細(xì)胞瘤、角化囊性瘤和含牙囊腫囊壁上皮層中RANK/RANKL/OPG信號通路的表達(dá)水平并對比分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能解釋各疾病之間部分臨床差異然而還是存在部分不足。實(shí)驗(yàn)中還觀察到囊壁的結(jié)締組織或腫瘤的間質(zhì)中也有不同水平的目標(biāo)蛋白表達(dá)，然而本文僅分析上皮結(jié)構(gòu)中各分子的表達(dá)水平。同時(shí)免疫組化的研究方法只能測定時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，疾病的發(fā)展是一個動態(tài)過程存在靜止期和穩(wěn)定期。我們期待有更好的方法準(zhǔn)確檢測牙源性腫瘤及非腫瘤病變中骨吸收破壞相關(guān)因子的水平差異。

單囊型成釉細(xì)胞瘤、角化囊性瘤、含牙囊腫都會造成頜骨的吸收，然而彼此之間存在不同X線特點(diǎn)，臨床上保守手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率也有差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單囊型成釉細(xì)胞瘤、角化囊性瘤和含牙囊腫的囊壁上皮結(jié)構(gòu)會分泌較口腔黏膜高水平的RANKL和低的OPG導(dǎo)致頜骨缺損的發(fā)生，而且OPG的表達(dá)水平存在“正常黏膜＞牙源性角化囊性瘤＞單囊型成釉細(xì)胞瘤”，我們認(rèn)為RANK/RANKL/OPG信號通路在含牙囊腫、牙源性角化囊性瘤、單囊型成釉細(xì)胞瘤的所造成的頜骨吸收中有重要作用并且OPG的表達(dá)水平差異與3組疾病的臨床差異有關(guān)聯(lián)。