電子束輻照對不同成熟度番茄后熟及乙烯生成的影響

王海宏 ， 孔秋蓮 *， 顏偉強(qiáng) ， 岳 玲 ， 馬 俊 ，陳志軍， 戚蓉迪， 包英姿， 戚文元

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物育種栽培研究所，上海 201403；2.上海束能輻照技術(shù)有限公司，上海 201403）

利用輻射源產(chǎn)生的γ射線、加速器產(chǎn)生的高能電子束或X射線輻照農(nóng)產(chǎn)品可殺蟲、滅菌、抑制酶活，在新鮮農(nóng)產(chǎn)品采后保鮮和檢疫等方面具有重要意義[1]。農(nóng)產(chǎn)品輻照加工是一種非熱加工技術(shù)，可有效地保持農(nóng)產(chǎn)品原有的品質(zhì)、色澤和營養(yǎng)成分[2]。輻照加工已被世界近60個國家或地區(qū)允許用于40多種食品的處理，以達(dá)到殺蟲、殺菌、抑制發(fā)芽等保障衛(wèi)生安全、延長貨架期等目的[1]。

電子束作為一種新型加工射線源，較傳統(tǒng)γ射線具有無放射廢物、劑量率高、經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點，近年來已成為新型輻照加工裝置的核心設(shè)備[3-4]。國內(nèi)外學(xué)者對電子束輻照加工農(nóng)產(chǎn)品開展了大量研究，但大都關(guān)注電子束輻照對產(chǎn)品品質(zhì)、微生物安全、保鮮效果等方面的影響[5-6]，對采后后熟過程的影響報道不多。雖然國外關(guān)于輻照可抑制新鮮果蔬乙烯生成的研究早有報道，但結(jié)論大都源于γ射線輻照裝置[7-8]。另外，為保證品質(zhì)和延長采后貯運時間，呼吸躍變型新鮮農(nóng)產(chǎn)品的采摘成熟度因采后用途不同而不同，而有關(guān)輻照，尤其是電子束輻照對不同成熟度果實的采后后熟影響則少見報道。

作者以呼吸躍變型果蔬番茄為試材，研究不同劑量電子束輻照對不同成熟度番茄的后熟及乙烯生成影響，為電子束輻照加工農(nóng)產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用提供進(jìn)一步的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同成熟度番茄

番茄（圣西娜）：采摘于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗站，成熟度按美國農(nóng)業(yè)部分類[9]，選取綠熟期（果實著紅面積0%）、粉熟期（果實著紅面積30%～60%）、紅熟期（果實著紅面積90%以上）三個成熟度采摘。采摘后立即運至實驗室，剔除病蟲害果、斑點果，小心去除花萼及果柄。所有果實均仔細(xì)挑選，保證色澤、大小基本一致，然后進(jìn)行輻照處理。

1.2 輻照處理

輻照在上海束能輻照技術(shù)有限公司進(jìn)行，輻照設(shè)備為日本IHI公司ESS-010-03直線電子加速器（能量10 MeV，功率10 kW）。

試驗設(shè) 3 個劑量處理，0、0.4、1.0 kGy， 每個劑量處理重復(fù)3次，每次重復(fù)輻照75個果實。所有輻照處理都在采摘后2 h內(nèi)完成。番茄果實單層擺放在托盤中，利用重鉻酸銀化學(xué)劑量計進(jìn)行劑量檢測，保證實際劑量在設(shè)定劑量的±10%范圍內(nèi)。

輻照處理結(jié)束后將75個果實隨機(jī)分成9組，其中6組每組10個果實，分別用于分析乙烯釋放量、保鮮效果及果皮紅色指數(shù)；另外3組每組5個果實，用于分析乙烯合成關(guān)鍵酶 （ACC合成酶ACS2、ACC氧化酶ACO1）基因表達(dá)量。所有果實均放置在紙盒中，在室溫下模擬貨架期條件存放（20±1℃，50%RH）14 d。存放期間定期取樣測定果皮紅色指數(shù)變化和乙烯釋放量，存放至第14天時，測定保鮮效果（皺縮率、失重率、霉變率）和ACC合成酶ACS2和ACC氧化酶ACO1基因的表達(dá)量。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 保鮮效果及后熟變紅程度

1）果實皺縮率：以皺縮果實個數(shù)占總調(diào)查果實個數(shù)的百分比表示。果實花萼處出現(xiàn)明顯皺縮即認(rèn)定為皺縮果實[10]。

2）果實失重率：

3）果實霉變率：以霉變果實個數(shù)占總調(diào)查果實個數(shù)的百分比表示。

4）果皮紅色指數(shù)：后熟變紅程度以果實紅色指數(shù)表示，果實分級參考美國農(nóng)業(yè)部番茄成熟度分類[9]，計算方法參考果實褐變指數(shù)[11]。0級：果實青綠，無變紅；1級：果實＜10%面積變紅；2級：果實10%～30%面積變紅；3級：果實30%～60%面積變紅；4級：果實60%～90%面積變紅；5級：果實＞90%面積變紅。

1.3.2 乙烯釋放量 氣相色譜法，參考王磊等方法[12]。番茄果實密封在對乙烯沒有吸附效果的塑料盒中，25℃下靜置15～16 h，采用頂空法，抽取1 mL氣體測定乙烯含量，并根據(jù)果實質(zhì)量和密封盒內(nèi)空氣體積計算乙烯釋放速率。乙烯含量測定使用氣相色譜（Model N6980，Agilent Inc.，Wilmington，USA）儀 。色譜條件為Porapak Q色譜柱，柱長1 m，內(nèi)徑3mm，檢測口溫度150℃，柱溫60℃，載氣（氮氣）流量25 mL/min，F(xiàn)ID檢測器。每次測定結(jié)束后，番茄果實放回各自的紙盒中，繼續(xù)模擬貨架期條件存放。乙烯釋放速率以 C2H2μL/（h·kg）表示。為比較不同處理番茄果實貨架期間乙烯釋放量的變化情況，以貨架期0 d時各處理的乙烯釋放速率為基準(zhǔn)值，計算各處理貨架期間的乙烯釋放速率與其相應(yīng)基準(zhǔn)值的比值，表示各處理貨架期間的乙烯釋放量的變化。

1.3.3 乙烯合成關(guān)鍵酶 ACC合成酶（ACS2）、ACC氧化酶（ACO1）基因的表達(dá)量分析 利用熒光定量PCR分析番茄ACO1和ACS2基因表達(dá)。番茄果肉組織加入2.5倍體積的Trizol試劑 （Invitrogen），勻漿后參照產(chǎn)品Trizol Reagent（Invitrogen）說明書步驟提取總的RNA。使用1 μg的RNA樣品反轉(zhuǎn)合成cDNA，具體步驟參照產(chǎn)品試劑盒PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）說明書。 熒光定量PCR使用試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII real time PCR Kit（Takara），具體步驟參考產(chǎn)品說明書。擴(kuò)增LeACS2引物為，正向 5'-GAGGTTCGTAGGTGTTGAGAAAAGT-3'，反向 5'-GGAATAGGTGACGAAAGTGGTGACA-3'[13]，擴(kuò)增LeACO1引物為，正向5'-ACAAACAGACGGGACA CGAA-3'，反向 5'-CTCTTTGGCTTGAAACTTGA-3'[14]，擴(kuò)增 LeTUA引物為，正向 5'-AGCTCATTAG CGGCAAAGAA-3'，反向 5'-AGTACCCCCACCAAC AGCA-3'[15]。其中Alpha-tubulin基因LeTUA被選作內(nèi)參用于標(biāo)準(zhǔn)化其他幾個基因表達(dá)的測定。每個處理中選3個番茄果實分析ACO1和ACS2基因表達(dá)，果實切片后立即放入液氮貯存在-80℃冰箱中待分析，切片均質(zhì)后一式三份用于每項分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對番茄保鮮效果的影響

由表1可以看出，貨架期存放14 d后，不同成熟度采摘的果實皺縮率均以0.4 kGy處理最低，其中綠熟果0.4 kGy電子束處理顯著低于紅熟果1.0 kGy電子束處理，其它各處理間無顯著差異。果皮失水皺縮的規(guī)律和失重率之間并未表現(xiàn)明顯相關(guān)性，貨架期間的番茄果實出現(xiàn)較大幅度失重，電子束輻照處理的果實失重率低于未輻照處理，但各處理間差異不顯著。番茄貨架期間的霉變率較低，各處理間番茄果實的霉變率無顯著差異。因此，不同劑量電子束輻照處理對番茄果實貨架期間的失重率和霉變率影響不顯著，對相同成熟度采收的番茄果實，不同劑量電子束輻照處理對貨架期間的皺縮率影響也不顯著。

2.2 電子束輻照對番茄后熟變紅的影響

番茄果實的表皮顏色可作為果實成熟程度的指示因子[9]。用果實表皮紅色指數(shù)衡量貨架期14 d番茄果實的后熟情況，從圖1看出，電子束處理抑制了果實的后熟變紅，相同成熟度果實間表現(xiàn)為電子束劑量越高，變紅受抑制程度越高；相同電子束劑量處理間則表現(xiàn)為采收成熟度越低，變紅受抑制程度越高。統(tǒng)計分析表明，電子束對番茄果實貨架期表皮變紅的影響因成熟度而異，粉熟期采收的果實不同劑量電子束處理間表皮變紅程度無顯著差異，其果皮紅色指數(shù)與紅熟期采收的果實也無顯著差異。綠熟期采收的番茄其貨架期間的果皮變紅程度受電子束處理影響較大，不同劑量間表現(xiàn)顯著差異，經(jīng)過貨架期14 d后熟存放后，其表皮紅色指數(shù)和紅熟期采收的果實差異顯著。

表1 電子束輻照對貨架期存放14 d后番茄果實的皺縮、失重和霉變的影響Table 1 Effects of E-beam irradiation on percent of winkle，weight loss and decay of tomatoes after 14 days of shelf-life

圖1 電子束輻照對貨架期存放14 d后番茄果實果皮紅色指數(shù)的影響Fig.1 Effects of E-beam irradiation on red color indexes of tomatoes skin after 14 days of shelf-life

2.3 電子束輻照對貨架期間番茄乙烯釋放量的影響

圖2顯示了貨架期間電子束輻照處理的番茄果實乙烯釋放量的變化情況。番茄果實采收后乙烯釋放量的變化受采收成熟度和輻照劑量的雙重影響。綠熟期采收的果實，電子束輻照處理的乙烯釋放量的變化小于未處理的對照果實；貨架期0～10 d內(nèi)乙烯釋放量快速增加，電子束輻照可抑制其增加幅度，其中貨架期0～5 d內(nèi)不同電子束劑量間差別不大，但5～10 d期間表現(xiàn)為1.0 kGy處理的乙烯釋放量大大高于0.4 kGy處理；在貨架期10～14 d內(nèi)，各處理的乙烯釋放量呈下降趨勢，不同劑量間表現(xiàn)為0 kGy處理乙烯釋放量最大，1.0 kGy處理次之，0.4 kGy處理最低。粉熟期采收的果實，其乙烯釋放量的變化低于綠熟期采收的果實，電子束輻照對乙烯釋放量變化的影響因劑量而異，0.4 kGy對乙烯釋放影響很少，和未輻照的對照處理差別不大，而1.0 kGy則促進(jìn)了乙烯釋放量的增大，貨架期5～14d內(nèi)明顯高于對照和0.4 kGy處理 。紅熟期采收的果實，其采后乙烯釋放量的變化最小，貨架期0～5 d內(nèi)乙烯釋放量下降，5 d后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，電子束輻照可增加其上升幅度，且劑量越高，增加幅度越大。

由此看出，電子束輻照處理可影響番茄果實的采后乙烯釋放，但影響效果因采摘成熟度而異。對成熟度低的綠熟期果實，電子束處理可抑制其乙烯釋放，從而抑制后熟。隨著成熟度提高，電子束輻照反而促進(jìn)了乙烯釋放，表現(xiàn)為劑量越高，促進(jìn)幅度越大。

圖2 電子束輻照對番茄果實貨架期間乙烯釋放量的影響Fig.2 EffectsofE-beam irradiation on ethylene production of tomatoes during shelf-life time

2.4 電子束輻照對番茄乙烯合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

植物體內(nèi)乙烯的生成量主要由1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）和氧化酶（ACO）決定，而這兩個關(guān)鍵酶生成量的多少是其mRNA表達(dá)的結(jié)果[16]。在番茄基因組中至少存在著12個ACS和7個ACO基因，其中LeACS2、LeACO1在番茄果實成熟過程中發(fā)揮主要作用[17]，Oeller等將ACS2基因反向插入載體并轉(zhuǎn)化番茄后，乙烯合成降低99.5%[18]。

作者選擇兩個有代表性的乙烯合成關(guān)鍵基因LeACS2和LeACO1，用定量熒光PCR測定其基因表達(dá)水平。由圖3可見，輻照對ACC合成酶、ACC氧化酶基因表達(dá)量的影響因成熟度而異。貨架期存放14 d后，綠熟期番茄果實的ACC合成酶和ACC氧化酶基因表達(dá)量均以未輻照處理最高，但不同劑量輻照處理果實的ACC合成酶基因表達(dá)量差異不大；而ACC氧化酶基因表達(dá)量則隨輻照處理劑量增加而降低。粉熟期和紅熟期番茄果實的ACC合成酶、ACC氧化酶基因表達(dá)量和輻照處理之間并未表現(xiàn)和綠熟期果實一樣的相關(guān)性，但都以1.0 kGy輻照處理的果實最低。因此，輻照處理對番茄果實乙烯合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響因成熟度而異，綠熟期果實的酶基因表達(dá)量受輻照抑制，且劑量越高，抑制幅度越大，和采后果皮紅色指數(shù)、乙烯釋放量變化的結(jié)果一致。

圖3 電子束輻照對貨架期14 d后番茄果實ACC合成酶、ACC氧化酶基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of E-beam irradiation on expression of ACS2，ACO1 genes of tomatoes after 14 days shelf-life time

3 討 論

新鮮果蔬采摘時的生理成熟程度是影響果實品質(zhì)和采后貯藏效果的重要因素。對番茄等呼吸躍變型果實，其摘收成熟度的選擇因采后貯藏時間長短要求而異。趙彤等研究采摘成熟度對番茄貯藏品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)紅熟前期果實 （著紅面積10%～40%）和紅熟中期果實（著紅面積40%～70%）采收后室溫下（18±2℃）存放，果實分別在13 d和5 d時完全變紅，腐爛率均為0%，失重率分別為0.63%和0.79%；而綠熟期果實（著紅面積0%）則于18 d時完全變紅，但腐爛率和失重率分別高達(dá)54.5%和1.53%，顯著高于其他采摘成熟度處理，提出紅熟前期和紅熟中期采摘的果實可用于短時間貯藏，綠熟期采摘的果實不利于貯藏[19]。作者研究發(fā)現(xiàn)，未輻照處理的番茄果實貨架期存放14 d后，綠熟期采摘番茄果實的失重率和皺縮率均高于粉熟期采摘果實，和趙彤等研究結(jié)果一致。但腐爛率方面，綠熟期采摘番茄果實和粉熟期采摘果實差別不大，原因可能在于番茄品種差異、栽培技術(shù)措施等方面。

輻照處理可抑菌、殺蟲、抑制果蔬的采后代謝強(qiáng)度，從而起到保鮮、檢疫的作用。G.J.STRYDOM等研究發(fā)現(xiàn)[20]，綠熟香蕉經(jīng)0.2 kGy輻照處理后，其后熟過程受到抑制。本研究同樣表明，輻照可抑制綠熟和粉熟番茄果實的后熟變紅，在1.0 kGy劑量范圍內(nèi)，劑量越高，抑制作用越大。輻照對番茄果實后熟變紅的抑制效果受采摘成熟度影響，相同輻照劑量下，綠熟果實的后熟受抑制程度大于粉熟果實。王愈等研究表明[21-22]，不同電場處理也可抑制番茄果實采后后熟變紅，原因可能在于電場處理可抑制葉綠素降解，同時通過延緩后熟，從而使處理番茄果實色澤轉(zhuǎn)變變慢。

番茄為典型的呼吸躍變型果實，果實的成熟受乙烯調(diào)控。程蕾等研究表明[23]，適宜濃度的乙烯抑制劑1-Pent CP和1-MCP能抑制番茄果實衰老，其作用機(jī)理可能是通過對果實乙烯受體基因表達(dá)的調(diào)控實現(xiàn)的。適宜劑量輻照處理也可抑制新鮮果蔬的后熟和衰老，但輻照對新鮮果蔬采后乙烯釋放的調(diào)控受品種等外在因素影響，乙烯釋放量變化和后熟轉(zhuǎn)化并不一定表現(xiàn)相關(guān)性。趙克儉等研究表明[24]，蘋果輻照后乙烯生成量變化因品種而異，晚熟品種國光輻照后乙烯生成量增加，而早熟品種伏蘋果輻照后乙烯生成量降低，且乙烯生成量隨輻照劑量增加而下降。G.J.STRYDOM等研究發(fā)現(xiàn)[20]，0.2 kGy輻照可抑制綠熟香蕉后熟過程，但導(dǎo)致乙烯釋放增加。本研究同樣表明，輻照可抑制綠熟和粉熟番茄果實的后熟變紅，但輻照對乙烯釋放量的影響因番茄果實的采摘成熟度而異，綠熟期采摘的番茄果實，輻照可導(dǎo)致其乙烯釋放量降低；而粉熟期采摘的番茄果實，1.0 kGy輻照導(dǎo)致乙烯釋放量升高。

乙烯作為重要的內(nèi)源激素，在果實發(fā)育、成熟老化、采后保鮮中起著非常重要的作用[25-26]。乙烯的生物合成途徑已經(jīng)于20世紀(jì)70年代末被明確，ACC合酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是乙烯生物合成的兩個關(guān)鍵酶[27]。有報道表明，1-MCP通過降低柿果ACS、ACO酶活性，達(dá)到降低內(nèi)源乙烯合成速度、抑制采后成熟軟化的效果[28]。程順昌等研究表明[29]，環(huán)丙烯類乙烯效應(yīng)抑制劑不同程度地抑制綠熟期番茄果實采后貯藏過程中的果實轉(zhuǎn)紅和乙烯釋放，同時抑制了ACS2和ACO1基因的表達(dá)量，認(rèn)為環(huán)丙烯類后熟抑制劑的作用可能主要是通過抑制番茄果實中ACS和ACO基因的表達(dá)而實現(xiàn)。本研究也表明，綠熟期采摘番茄果實的ACC合成酶（ACS2）和ACC氧化酶（ACO1）基因表達(dá)量低于粉熟期和紅熟期采摘的番茄果實，輻照處理導(dǎo)致綠熟期番茄果實的ACC合成酶（ACS2）和ACC氧化酶（ACO1）的基因表達(dá)量降低，和果皮紅色指數(shù)、乙烯釋放量的變化結(jié)果一致。因此認(rèn)為，電子束輻照抑制綠熟番茄果實后熟變紅的原因之一是通過抑制乙烯合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，進(jìn)而抑制乙烯的生成釋放，從而抑制果實后熟轉(zhuǎn)色。

綜上所述，適宜劑量輻照處理可抑制新鮮果蔬的后熟衰老，對番茄等呼吸躍變型果蔬，較低的采摘成熟度可增強(qiáng)輻照處理對果蔬后熟衰老的抑制效果，綜合考慮食用品質(zhì)、保鮮時長等因素，選擇適宜的采摘成熟度是保證電子束最佳輻照保鮮效果的關(guān)鍵。

4 結(jié)語

采摘時的生理成熟程度是影響番茄果實采后電子束輻照保鮮技術(shù)效果的重要因素。采用1.0 kGy及以下劑量電子束輻照處理低成熟度的綠熟期番茄果實，可延緩果實后熟變紅，保持較低的乙烯釋放量和乙烯合成關(guān)鍵酶（ACS2、ACO1）基因表達(dá)量，貨架（20±1 ℃，50%RH，14 d）期間的失重、皺縮、霉變未受到顯著影響。