蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵上清液抑菌譜及穩(wěn)定性

賈淑穎， 郝再彬， 陳圣怡， 韓兵兵， 李 霞

（桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004）

蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種天然革蘭氏陽性昆蟲病原細菌，生長代謝過程中產(chǎn)生的晶體蛋白對多種害蟲有特異毒殺作用，是目前最廣泛的微生物殺蟲劑[1]。Bt的抗菌防病機制是通過產(chǎn)生抗菌物質抑制病原生長或直接殺滅病原。Bt產(chǎn)生的拮抗物質主要有抗生素、細胞壁降解酶類、細菌素和其它抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌物質等，其中抗生素包括多肽抗生素、脂肽抗生素和次生代謝產(chǎn)生的其它抗菌活性物質等。近幾年，國內研究多數(shù)是在殺蟲方面，Bt以色列亞種開發(fā)的滅蚊制劑、防治儲糧害蟲的Bt殺蟲劑已投放市場[2]，對倉儲煙草害蟲、松材線蟲病的研究也在進行[7-8]。也有研究表明，該抑菌物質對蘋果輪紋菌（Dothiorella gregaria）、蘋果褐斑病菌（Marssonin mali）、尖孢鐮刀菌 （Fusarium oxysporum）、白菜黑斑菌（Alternaria brassicae）等植物病害微生物有明顯的抑菌作用[3]。

作者選取Bt185和HD-1菌株對它們的發(fā)酵液抑菌譜和穩(wěn)定性進行研究，為發(fā)酵液的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt185、HD-1 以 及 草 生 歐 文 氏 桿 菌LS005（Erwinia herbicol）供試菌：由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、普通變形球菌（Proteus vulgaris Hauser）、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、乙型副傷寒桿菌 （Bacillus paratyphosus B）、綠膿桿菌（Bacillus aeruginosus）：由桂林醫(yī)學院提供。

1.1.2 試劑 石油醚、正丁醇、三氯甲烷、四氯化碳、乙酸乙酯、異戊醇、葡萄糖、NaCl、MnSO4·H2O、K2HPO4、MgSO4等試劑：均為分析純；蛋白胨、酵母粉：英國OXOID公司；瓊脂：北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏：上海藍季生物。

1.1.3 主要設備 RE-52A I型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ-400型高功率數(shù)控聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；CL-5-B離心機：上海安亭科學儀器廠；LRH-150-Z振蕩培養(yǎng)箱：珠江醫(yī)療器械。

1.1.4 培養(yǎng)基 1/2 LB固體培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨5，酵母粉2.5，氯化鈉 5，瓊脂粉15。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 20，無水氯化鈣 0.8，K2HPO41.3，MgSO40.2，MnSO4·H2O 0.8。調節(jié) pH 至 7.0～7.2，封口滅菌備用。

抑菌培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3、蛋白胨10、氯化鈉5、瓊脂 15。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液預處理 將甘油管保存的Bt185、HD-1菌株分別接入滅好菌的1/2 LB液體培養(yǎng)基中（約 10 μL），30 ℃下培養(yǎng) 8～12 h（OD600＞0.8），為種子液。

將上述種子液分別按體積分數(shù)5%接入滅好菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃振蕩發(fā)酵48～50 h。

發(fā)酵液4 500 r/min離心15 min，取上清液，濃縮10倍。

1.2.2 抗菌譜 采用牛津杯法測定發(fā)酵液對供試菌的抑菌活性。將供試菌種子液按5%的接種體積分數(shù)加入抑菌培養(yǎng)基中，將處理后的發(fā)酵液150 μL加入到牛津杯孔中，按供試菌的適宜溫度放入相應溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑。牛津杯：內徑（6±0.1）mm、外徑（8±0.1）mm、高（10±0.1）mm的圓筒形小管。

1.2.3 發(fā)酵液穩(wěn)定性測定

1）發(fā)酵液熱處理：取適量處理后的發(fā)酵液分成10等分，分別在4℃冰箱、室溫約20℃（對照）、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃溫度梯度下恒溫 2 h，分別測定抑菌圈（草生歐文氏桿菌）大小。

2）發(fā)酵液酸堿處理：取適量處理后的發(fā)酵液分成 9 等分，分別調 pH 3、4、5、6、自然 pH 約為 7（對照）、8、9、10、11，2 h 后調回自然 pH，分別測定抑菌圈（草生歐文氏桿菌）大小。

3）發(fā)酵液超聲處理：取適量處理后的發(fā)酵液分成10等分，在溫度40℃，功率360 W超聲條件下，分別超聲 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h，分別測定抑菌圈（草生歐文氏桿菌）大小。

4）發(fā)酵液紫外處理：取適量處理后的發(fā)酵液分成 10 等分，放在 20 W 紫外燈下 15、30、45、60、75、90、105、120、135、150 min，分別測定抑菌圈（草生歐文氏桿菌）大小。

1.2.4 有機試劑萃取 將發(fā)酵液濃縮液分成6等分（對照為原液），分別加入等量的萃取劑，反復振蕩混合，于4℃冰箱靜置分層或離心分層，分別測定水相、有機相、原有機試劑及原液的抑菌圈大小。以草生歐文氏桿菌為供試菌。

選用的萃取劑（極性大小順序）：異戊醇＞三氯甲烷＞乙酸乙酯＞正丁醇＞四氯化碳＞石油醚。

2 結果與分析

2.1 抗菌譜的測定

通過比較發(fā)酵上清液對9種供試菌抑菌性發(fā)現(xiàn)，草生歐文氏桿菌抑菌最明顯，其次是普通變形球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，對比發(fā)酵液穩(wěn)定性時，采用草生歐文氏桿菌，見表1。

表1 供試菌的最適溫度及發(fā)酵上清液對9種指示菌抑菌圈直徑測定Table 1 Optimal temperature for test bacteria and the diameter of inhibition zone of 9 kinds of indicator bacteria concentration of fermentation broth

2.2 不同濃度發(fā)酵上清液的抑菌效果

由表2可看出：發(fā)酵液的濃度越高，抑菌能力越強。

表2 不同濃度發(fā)酵液的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone ofdifferent concentration of fermentation liquid

2.3 發(fā)酵上清液穩(wěn)定性

2.3.1 溫度對發(fā)酵上清液穩(wěn)定性的影響 由圖1可知，Bt185和HD-1發(fā)酵上清液均具有較高的熱穩(wěn)定性，50℃以上，抑菌圈明顯變小，即抑菌物質逐漸失活，80℃以上，幾乎沒有抑菌。以上實驗結果說明，Bt185和HD-1發(fā)酵上清液在低于50℃時，熱穩(wěn)定性較好。

圖1 發(fā)酵液溫度穩(wěn)定性Fig.1 Fermentation liquid temperature stability

2.3.2 pH對發(fā)酵上清液穩(wěn)定性的影響 由圖2可見，在酸性環(huán)境中，發(fā)酵上清液的抑菌活性較穩(wěn)定；在堿性環(huán)境中，抑菌活性有明顯下降，當發(fā)酵上清液pH=10時，幾乎沒有抑菌活性，將發(fā)酵上清液調回pH＜9時，抑菌物質失活，沒有抑菌性。由此可以得出在發(fā)酵上清液處理時，應該保持在pH 3～9的條件。

圖2 發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性Fig.2 Fermentation liquid acid-base stability

2.3.3 超聲作用對發(fā)酵上清液的影響 由圖3可見，在超聲波不斷刺激的條件下，Bt185菌株和HD-1菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性下降，說明Bt185和HD-1發(fā)酵上清液在超聲波的條件下穩(wěn)定性較差，在連續(xù)超聲3.5 h后，發(fā)酵上清液對草生歐文氏桿菌幾乎沒有抑制性。

圖3 發(fā)酵液超聲穩(wěn)定性Fig.3 Fermentation liquid ultrasonic stability

2.3.4 紫外光照對發(fā)酵上清液穩(wěn)定性的影響 由圖4可見，Bt185和HD-1發(fā)酵上清液對紫外光具有較好的穩(wěn)定性，經(jīng)過紫外光連續(xù)照射150 min，發(fā)酵上清液仍有較高的抑菌活性。

圖4 發(fā)酵液紫外光照射穩(wěn)定性Fig.4 Fermentation liquid UV irradiation stability

2.4 有機試劑萃取

由表3可看出，Bt185發(fā)酵上清原液石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷的萃余相的抑制圈直徑明顯比萃取相都大，與原液相比就不是很明顯。原液的抑菌圈直徑比四氯化碳和異戊醇萃取相及萃余相都明顯大。因此可得知Bt185發(fā)酵液的大多數(shù)抑菌活性物質為弱極性物質。

表3 發(fā)酵上清液萃取后各相的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameter of each phase after extraction of fermentation broth mm

HD-1發(fā)酵液原液的抑菌性明顯比萃取相和萃余相的抑菌性大，其中石油醚、四氯化碳、正丁醇、三氯甲烷和異戊醇的萃余相的抑制圈直徑比萃取相都大，而乙酸乙酯的萃取相的抑制圈明顯比萃余相大。因此可得知HD-1發(fā)酵液的大多數(shù)抑菌活性物質為極性物質。

3 結語

通過本研究發(fā)現(xiàn)，Bt185、HD-1菌株發(fā)酵上清液抑菌活性均具有進一步研究開發(fā)的價值。發(fā)酵上清液對種供試細菌均有不同程度的抑制作用，對草生歐文氏桿菌的抑制作用最強。為了得到高濃度的抑菌活性物質，應該濃縮更高的倍數(shù)，然后進一步純化得到純品。

Bt185、HD-1菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性研究表明，避免高溫處理；適宜的pH范圍較廣但不耐堿；連續(xù)超聲的條件下，時間要控制在2 h內，抑菌物質才不易被破壞；紫外照射條件下影響不大，活性成分較為穩(wěn)定。Bt185菌株發(fā)酵液的抑菌性物質為弱極性物質，可以隨著萃取試劑萃取出來，而HD-1菌株發(fā)酵液的抑菌性物質為極性物質，不易萃取，下一步需驗證不同菌株產(chǎn)生的抑菌物質是否為同一種結構。Bt185菌株的各項穩(wěn)定性都要優(yōu)于HD-1菌株，工業(yè)化生產(chǎn)中有一定的優(yōu)勢。