不同酵母多糖對蛇龍珠干紅葡萄酒品質(zhì)的影響

尹寧寧 ， 許引虎 ， 李 敏 ， 韓舜愈 ， 王 婧 *

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.安琪酵母股份有限公司 ，湖北 宜昌 443003）

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母：釀酒酵母Fermicru VR5，購自荷蘭DSM Food Specialties公司；蛇龍珠葡萄品種：來自甘肅民勤釀酒葡萄種植基地；酵母多糖、非活性酵母、酵母葡聚糖、酵母甘露聚糖：由安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 主要試劑

2-辛醇：色譜純，SIGMA-ALDRICH（上海）貿(mào)易有限公司；福林酚顯色劑：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；碳酸鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；均為分析純。

1.3 主要儀器

CP214型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥器：北京科偉永興儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計：美國Thermo Scientific公司；18100摩爾超純水機：上海摩勒科學儀器有限公司；TG-WAX氣相色譜柱：美國Thermo Scientific公司；TRACE1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 酵母多糖的添加 酵母多糖在蘋-乳發(fā)酵之后陳釀前進行添加，設(shè)置3種酵母多糖的不同添加量（0.15、0.3、0.45、0.6 g/L），并設(shè)平行與空白對照。具體操作工藝如下：

酵母多糖是源于酵母細胞壁或酵母中的大分子多糖復(fù)合物，主要由β-葡聚糖、甘露聚糖和少量幾丁質(zhì)組成[1]。這些大分子糖質(zhì)膠體可以增強葡萄酒中蛋白質(zhì)和酒石的穩(wěn)定性，均衡葡萄酒組分，增加其圓潤感和后味，增強葡萄酒香氣的復(fù)雜性[2]。目前在葡萄酒釀造工藝中的帶酒泥陳釀就是為了利用酵母自溶釋放出的酵母多糖來改善葡萄酒的品質(zhì)，然而酵母多糖在酒泥陳釀過程中釋放太慢，使得該方法成本高、時間長并存在其他質(zhì)量風險[2]。因此，如何利用商業(yè)酵母多糖產(chǎn)品，建立一種方便、快捷、安全的方法來提高干紅葡萄酒的品質(zhì)十分必要。

國外在20世紀末就開始對葡萄酒中的多糖來源以及作用進行了研究。SaucierS等[3]人研究發(fā)現(xiàn)，釀造過程中加入酵母多糖后赤霞珠葡萄酒較未加入多糖的葡萄酒圓潤感及單寧的細膩感明顯增加。Vernhet.V等[4]研究發(fā)現(xiàn)，阿拉伯半乳聚糖和甘露糖蛋白能夠同酒石晶核結(jié)合，阻礙其增長，維持酒體的穩(wěn)定性。Guadalupe.Z等[5]研究表明，甘露糖蛋白可以與葡萄酒中的單寧反應(yīng)，降低葡萄酒的苦澀感，增加其圓潤感。近幾年，國內(nèi)也有學者對葡萄酒中的多糖來源以及作用進行了研究。李華[6]研究顯示，甘露糖蛋白可以提高葡萄酒香氣的馥郁性。許引虎等[7]研究表明，酵母多糖能顯著改善葡萄酒的酒體結(jié)構(gòu)，增加飽滿度、均衡酒體、提高色素穩(wěn)定性、降低單寧的粗糙感和葡萄酒的生青味。

目前，葡萄酒工業(yè)中普遍使用帶酒泥陳釀的方法來增加葡萄酒中酵母多糖的含量，然而，在陳釀過程中酵母的自溶過程在一定程度上具有不可控性，并且如果處置不當會造成葡萄酒的生青味突出，加劇葡萄酒的氧化，導(dǎo)致有害微生物滋生[8]。因此，如何利用商業(yè)酵母多糖的添加來代替酒泥陳釀是提高葡萄酒品質(zhì)的研究方向之一，而且該技術(shù)在蛇龍珠干紅葡萄酒上的應(yīng)用研究尚未見報道。

作者以3種不同的酵母多糖為研究對象，分析其對蛇龍珠干紅葡萄酒理化指標、香氣物質(zhì)成分及感官品質(zhì)的影響，旨在為酵母多糖在干紅葡萄酒中的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

葡萄原料→篩選、除梗、破碎→加入SO2、果膠酶→浸漬→加酵母菌VR→酒精發(fā)酵→皮渣分離→蘋-乳發(fā)酵→換桶、過濾→陳釀（加入酵母多糖）→陳釀60 d后檢測。

1.4.2 基本理化指標的的測定

1）總酸：參照GB/T 15038-2006方法，略作修改。2 mL酒樣加入50 mL蒸餾水，滴入2滴酚酞指示劑混勻，NaOH標準溶液滴定，滴定至30 s不變色。記錄體積V1，計算公式如下：

式中，X為樣品中酸質(zhì)量濃度g/L；c為NaOH濃度mol/L；V0為空白實驗溶液的體積；V1為NaOH標準溶液消耗的體積；V2為酒樣的體積。

2）柔和指數(shù)：計算公式如下[9]

式中，S為酒樣柔和指數(shù)；A為酒精度，單位%（v/v）；T為單寧質(zhì)量濃度，單位g/L；C為總酸質(zhì)量濃度，單位g/L。

3）色度色調(diào)：參照李素岳[10]的方法。準確吸取酒樣1 mL，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，取稀釋后的酒樣于1 cm光程比色皿中，分別在420、520、620 nm下測定吸光度值，三者之和即為該酒樣的色度值，前兩者吸光度值之比即為色調(diào)值。

4）單寧：參照崔日寶[11]方法，略作修改。以一水合沒食子酸的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到單寧標準曲線方程。吸取1 mL酒樣，定容至100 mL。然后吸取1 mL樣品溶液分別加入蒸餾水 5 mL，F(xiàn)C顯色劑 （1 mol/L）1 mL和7.5%碳酸鈉溶液3 mL顯色。靜置2 h后，在765 nm波長下測定樣品的吸光度，再根據(jù)標準曲線方程計算出樣品中單寧的質(zhì)量濃度。計算公式如下：

式中，ρ為測定樣中一水合沒食子酸的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL；10為測定樣定容體積，單位為mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；V為酒樣體積，單位為mL。

5）總花色苷：pH示差法[12]。吸取葡萄酒酒樣0.5 mL，用pH 1.0緩沖液定容至10 mL。室溫平衡100 min后，以蒸餾水為空白，分別在521 nm處和700 nm處測定吸光值。用同樣的方法測定樣品在pH 4.5緩沖溶液中的吸光度值。利用公式進行計算：

式 中 ，A=（Aλmax-A700nm）pH1-（Aλmax-A700nm）pH4.5；MW=493.2 g/mol（錦葵色素-3-葡萄糖苷）；DF為稀釋倍數(shù)；1=光程的厘米數(shù)；ε=28 000摩爾消光系數(shù)。

1.4.3 香氣物質(zhì)檢測

1）香氣物質(zhì)提取：取5 mL酒樣，置于15 mL的樣品瓶中，分別加入1.5 g NaCl和50 μL內(nèi)標物2-辛醇，放入攪拌轉(zhuǎn)子后用瓶塞密封，置于磁力攪拌器上30 min，室溫條件下萃取30 min。

2）色譜條件：初溫40℃保持5 min，以3℃/min升至180℃保持5 min，進樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度280℃，載氣流速1 mL/min，GC運行時間57 min。

3）質(zhì)譜條件：電子電離源（electron inoization，EI），電離源能量70 eV，傳輸桿溫度180℃，離子源溫度240℃，質(zhì)量掃描范圍m/z為50～350。

4）定性定量方法：定性：香氣成分利用 MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據(jù)色譜保留時間和質(zhì)譜信息、NIST08標準譜庫比對結(jié)果以及參考相關(guān)文獻相結(jié)合的方法進行定性分析[13-15]。定量：采用內(nèi)標法進行定量分析，內(nèi)標物選用2-辛醇。

1.4.4 感官評定 感官分析根據(jù) （González-Sanjosé，Ortega-Heras，and Pérez-Magariéo 2009）描述的方法略有調(diào)整[16-17]。使用7分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化，1代表沒有感覺，7代表感覺非常強烈。感官評價在作者所在學院標準品嘗室中進行，并選擇8名經(jīng)過專業(yè)培訓并具有葡萄酒品鑒資格證的葡萄酒專業(yè)老師和學生進行感官評定。從顏色強度、酸度、收斂性、圓潤度、香氣濃郁程度、平衡感、總體評分等7個方面對各葡萄酒樣品進行品評。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用 Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并利用Duncan’s多重比較在置信區(qū)間 0.05下對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母多糖對蛇龍珠干紅葡萄酒基本理化指標的影響

2.1.1 酵母多糖的添加量對總酸的影響 3種酵母多糖不同添加量對蛇龍珠干紅葡萄酒總酸的影響結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，添加了3種酵母多糖的處理，其葡萄酒中總酸質(zhì)量濃度明顯降低，隨著酵母多糖添加量的增加，總酸質(zhì)量濃度均呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢。當多糖添加量為0.15 g/L其總酸質(zhì)量濃度較之空白對照組差異顯著（P＜0.05），酵母甘露聚糖的添加量為0.3 g/L時，總酸質(zhì)量濃度最低為5.20 g/L，比空白對照組總酸質(zhì)量濃度降低了13.3%，當多糖添加量大于0.4 g/L時，總酸質(zhì)量濃度不再降低，其質(zhì)量濃度基本趨于穩(wěn)定；當非活性酵母、酵母葡聚糖的添加量均在0.45 g/L時，總酸質(zhì)量濃度最低為5.25 g/L和5.26 g/L，較之空白對照組分別降低了12.5%和12.3%，且隨其添加量的增加總酸質(zhì)量濃度均趨于穩(wěn)定。3種多糖相比較，甘露聚糖的降酸效果最佳，這可能與多糖中甘露糖蛋白質(zhì)量濃度有關(guān)，酵母甘露聚糖中甘露糖蛋白的質(zhì)量濃度均高于其他兩種多糖，本試驗研究結(jié)果表明，酵母多糖能夠顯著降低干紅葡萄酒的酸度，這與榮俊聲等[18]在干白葡萄酒中上的研究結(jié)果相似。

2.1.2 酵母多糖的添加量對色度的影響 由圖2可知，隨酵母多糖添加量的增加，蛇龍珠干紅葡萄酒色度的變化整體呈先上升后平緩的變化趨勢。當添加量為0.15 g/L時，試驗組的色度值較之空白對照組差異不顯著（P＞0.05）；當非活性酵母，酵母葡聚糖與酵母甘露聚糖的添加量分別在0.45、0.45、0.3 g/L時，色度值達到峰值，其色度較空白對照組差異顯著（P＜0.05），并分別提高了 11.5%，13.1%，16.4%，且酵母甘露聚糖添加量為0.3 g/L的色度值均高于其他兩種多糖添加量為0.45 g/L的色度值，這一結(jié)果表明，當3種酵母多糖的添加量在0.3～0.45 g/L時能夠明顯提高葡萄酒色度，且酵母甘露聚糖效果最佳。葡萄酒的色度是評價葡萄酒外觀質(zhì)量的一個重要標準，葡萄酒色度的高低主要由葡萄酒中的酚類物質(zhì)如花色素苷、單寧等決定的，花色素苷、單寧含量越高，葡萄酒的顏色就越深，色度值也就高[19]。

2.1.3 酵母多糖的添加量對色調(diào)的影響 由圖3可以看出，隨著酵母多糖添加量的增加，色調(diào)值呈下降的趨勢。當酵母甘露聚糖添加量在0.3 g/L時，其色調(diào)值最低，為0.61，較空白對照組色調(diào)值降低了15.2%；而當非活性酵母與酵母葡聚糖的添加量為0.45 g/L時，其色調(diào)值最低，為0.62和0.61，分別降低了13.9%和15.2%，且3個試驗組均較空白對照組差異顯著（P＜0.05）。 Escot.等[20]人研究表明，甘露糖蛋白與游離色素結(jié)合，生成色素化合物阻止了花青素聚集沉淀。而本試驗色調(diào)的演變結(jié)果印證了以上觀點，葡萄酒在420 nm時有較低的紅光吸收率，而在520 nm時有較高的紅光吸收率，兩者的比值減小是色調(diào)值逐漸下降的主要原因，由此說明加入酵母多糖對葡萄酒保持相對新鮮的紅色色澤具有積極作用。

圖1 酵母多糖添加量對總酸質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of yeast polysaccharide content on total acid content

圖2 酵母多糖添加量對色度的影響Fig.2 Effect of yeast polysaccharide on chroma

2.1.4 酵母多糖的添加量對單寧的影響 單寧是評價葡萄酒品質(zhì)的重要指標。由圖4可知，3種酵母多糖對單寧的影響趨勢基本一致，隨著酵母多糖添加量的增加，單寧含量呈下降趨勢。非活性酵母、酵母葡聚糖與酵母甘露聚糖的添加量分別為0.45、0.45、0.3 g/L時單寧含量最低，分別為1.62、1.64、1.64 g/L，較空白對照組降低了13.4%、12.3%、12.3%，且變化趨勢隨多糖添加量增加逐漸減緩?？赡苁怯捎诮湍付嗵穷愇镔|(zhì)尤其是甘露糖蛋白與單寧酸等酚類物質(zhì)相互作用，形成大分子聚合物，從而維持葡萄酒單寧的穩(wěn)定，提高了酒體的圓潤度。有國外學者研究表明，葡萄酒中粗糙單寧含量影響葡萄酒的口感和品質(zhì)，而多糖可以結(jié)合部分單寧以干擾了單寧的粒度來維持酒體中單寧的穩(wěn)定[21]。

圖3 酵母多糖添加量對色調(diào)的影響Fig.3 Effect of adding amount of yeast polysaccharide on hue

圖4 酵母多糖對單寧質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of yeast polysaccharide on tannin content

2.1.5 酵母多糖對總花色苷的影響 由圖5可知，總花色苷質(zhì)量濃度隨酵母多糖添加量的增加呈逐漸上升的趨勢，非活性酵母、酵母葡聚糖與酵母甘露聚糖的添加量分別在0.45、0.45、0.3 g/L時，總花色苷質(zhì)量濃度達到峰值，其中添加酵母甘露聚糖的試驗組質(zhì)量濃度最高，為292.4 mg/L，較空白對照組提升了15.3%。這可能是由于酵母多糖結(jié)合葡萄酒中的單體花色素，相互作用形成色素聚合物，從而阻止了部分色素的聚集沉淀[22]。而Asenstorfer[23]研究表明，酵母多糖的某些成分有利于形成新的聚合花色苷，這會使酒體更穩(wěn)定、耐受pH變化和氧化反應(yīng)，從而有助于酒體顏色的穩(wěn)定。隨多糖添加量的增加，總花色苷質(zhì)量濃度有所降低但變化不大，可能是由于形成的多糖色素聚合物聚集而沉淀。

圖5 酵母多糖添加量對總花色苷質(zhì)量濃度的影響Fig. 5 Effect of yeast polysaccharide on total anthocyanins

2.1.6 酵母多糖的添加量對柔和指數(shù)的影響 柔和指數(shù)反映了葡萄酒的口感、收斂程度和平衡感[24]。由圖6可以看出，添加多糖的試驗組柔和指數(shù)均達到5.0以上，多糖添加量在0.3 g/L時，添加酵母甘露聚糖的試驗組的柔和指數(shù)達到峰值；而多糖添加量在0.45 g/L時，添加非活性酵母及酵母葡聚糖的試驗組柔和指數(shù)最高。有研究表明，柔和指數(shù)達到5.0以上的葡萄酒品質(zhì)較好[25]。

圖6 酵母多糖添加量對柔和指數(shù)的影響Fig.6 Effect of the amount of yeast polysaccharide on the soft index

2.2 酵母多糖對蛇龍珠干紅葡萄酒香氣物質(zhì)的影響

根據(jù)理化指標的分析結(jié)果，分別以3種酵母多糖影響效果最優(yōu)的試驗組進行，非活性酵母與酵母葡聚糖選用添加量為0.45 g/L的試驗組，酵母甘露聚糖選用添加量為0.3 g/L的試驗組，各試驗組其香氣成分及質(zhì)量濃度見表1。

表1 蛇龍珠干紅葡萄酒香氣成分及質(zhì)量濃度Table 1 Volatile compounds in wines produced of Cabernet Gernicht wine

續(xù)表1

2.2.1 酯類化合物 酯類化合物是對葡萄酒整體香氣組成具有積極貢獻作用的一類重要物質(zhì)。由表1可知，添加非活性酵母、酵母葡聚糖及酵母甘露聚糖的試驗組與空白對照組相比，試驗組檢測出的酯類物質(zhì)分別為18種、17種、19種，而空白對照組只檢測到13種，其質(zhì)量濃度分別為 6.03、5.4、6.45、5.15 mg/L。試驗組檢測出新的風味物質(zhì)有乙酸己酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸戊酯、辛酸-3-甲基丁酯、10-十一烯酸乙酯、棕櫚酸乙酯等6種酯類物質(zhì)。由此可見，添加酵母多糖可增加酯類物質(zhì)的種類與質(zhì)量濃度，其中添加酵母甘露聚糖的試驗組酯類物質(zhì)種類與質(zhì)量濃度最高，較對照組提高了46.15%和25.24%。Lubber等[26]研究證明，作為酵母多糖主要成分的甘露糖蛋白，其蛋白端可通過與酒體中香氣物質(zhì)作用來增加香氣的穩(wěn)定性并提高香氣持久性。

此外，添加酵母多糖的葡萄酒中具有花香、果香的乙酯化合物質(zhì)量濃度明顯增多。例如乳酸乙酯具有果香、朗姆酒味、牛奶香味，添加酵母甘露聚糖的試驗組質(zhì)量濃度最高達到0.50 mg/L；而具有梨香、白蘭地香的癸酸乙酯，試驗組質(zhì)量濃度均達到1mg/L以上。這些香氣物質(zhì)能賦予葡萄酒獨特的香氣，增加其香氣馥郁性、協(xié)調(diào)感，提高葡萄酒品質(zhì)。

2.2.2 醇類物質(zhì) 醇類化合物是葡萄酒樣中檢測到的又一大化合物，主要由發(fā)酵過程中糖代謝產(chǎn)生。由表1可知，試驗組與對照組比，醇類物質(zhì)的種類與質(zhì)量濃度均相差不大。3個多糖試驗組均檢測出10種醇類物質(zhì)，空白對照組檢測出8種，其質(zhì)量濃度分別為 6.00、6.40、6.13、6.07 mg/L。 可能是由于醇類物質(zhì)大部分來源于酒精發(fā)酵階段，而酵母多糖添加于陳釀前，使得試驗組與對照組的醇類物質(zhì)相差不大。

2.2.3 酸類物質(zhì) 酸類化合物是葡萄酒發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物，當質(zhì)量濃度過高時會對葡萄酒的感官質(zhì)量造成負面影響。由表1可知，試驗組與空白對照組分別檢測出9種、9種、8種與9種，總質(zhì)量濃度分別為 1.51、1.52、1.49、1.61 mg/L，其中添加甘露聚糖的試驗組質(zhì)量濃度最低，較空白對照組降低了7.5%。酸類化合物種類差別不大，質(zhì)量濃度明顯降低，可能是由于多糖物質(zhì)與揮發(fā)性酸類化合物相互作用降低了揮發(fā)性酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度。

2.2.4 醛酮及萜稀類化合物 添加非活性酵母，酵母葡聚糖及酵母甘露聚糖的試驗組檢測到的醛酮及萜稀類物質(zhì)分別為7種、7種、8種，而對照組檢測到4種。試驗組檢測出的風味物質(zhì)有大馬士酮、癸醛、松油醇、香茅醇、6-叔丁基間甲酚，其中添加酵母甘露聚糖的試驗組醛酮及萜稀類化合物種類與質(zhì)量濃度到達最高，較空白對照組均提升了50%。雖然這些物質(zhì)在葡萄酒中質(zhì)量濃度較低，但對總體的風味構(gòu)成起到了積極作用，如萜稀類物質(zhì)可以賦予酒體花香，果香和植物香，對提高酒體的整體風味具有一定貢獻[27-28]。

2.3 感官分析

由圖7可以看出，試驗組和對照組清澈度和酸度差異不明顯，其他項目均有較大的差異。從顏色強度來分析，試驗組的顏色強度值均高于對照組，可能是由于多糖與酚類物質(zhì)結(jié)合，阻止了與單寧相互作用，維持紅葡萄酒的顏色穩(wěn)定。而從口感收斂性與圓潤程度來分析，對照組的收斂性較強而圓潤度較低，這可能與單寧質(zhì)量濃度有關(guān)。酵母多糖結(jié)合葡萄酒中的單寧，掩蓋了某些單寧的粗糙感和生青味，降低了收斂感，增加了葡萄酒的圓潤程度。從香氣濃郁度與整體評分分析，空白對照組的香氣濃郁度與整體評分最低，添加酵母甘露聚糖的試驗組香氣濃郁度與整體評分最高，具有濃烈的果香與花香，受歡迎程度較高。

圖7 感官分析雷達圖Fig.7 Radar map of sensory analysis

3 結(jié)語

通過添加3種不同酵母多糖，分析其對蛇龍珠干紅葡萄酒品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，3種多糖均對葡萄酒品質(zhì)具有積極作用。其中，非活性酵母、酵母葡聚糖及酵母甘露聚糖的添加量分別為0.45，0.45，0.3 mg/L時影響效果最顯著，且酵母甘露聚糖作用效果最佳，可降低葡萄酒的酸度，穩(wěn)定葡萄酒顏色，使其更加亮麗。酵母多糖結(jié)合酒中的粗糙單寧，減少單寧質(zhì)量濃度，平衡葡萄酒構(gòu)架使其口感更加柔和，圓潤。同時，添加酵母多糖可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，穩(wěn)定香氣成分，提高香氣的持久性。