左亞葉酸鈉注射液局部安全性實驗研究

林 鵬，王麗娜，章穎慧，焉媛媛，王秀英，信婷婷，吳英良

(1.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016；2.遼寧省藥品檢驗檢測院藥理室，沈陽 110036；3.沈陽抗生素廠質(zhì)控處，沈陽 110122)

左亞葉酸是亞葉酸的5-甲酰衍生物的非對映異構(gòu)體混合物的左旋體，具有生物活性[1]。左亞葉酸鈉是左亞葉酸的二鈉鹽，在臨床上用作葉酸拮抗劑如甲氨蝶呤的解毒劑[2]，也可與5-氟尿嘧啶合用增強(qiáng)5-氟尿嘧啶在腫瘤治療中的療效，用于治療胃癌和結(jié)直腸癌[2]。臨床上左亞葉酸鈣的應(yīng)用要比左亞葉酸鈉廣泛，但其聯(lián)合用藥時不良反應(yīng)的報道履見[3-4]。左亞葉酸的鈉鹽和鈣鹽藥動學(xué)特征基本一致[5]，但左亞葉酸的鈉鹽相較于其鈣鹽具有良好的水溶性和生物相容性，能避免合并5-氟尿嘧啶引起的輸液管堵塞現(xiàn)象和輸注速度不宜過快的缺點，在臨床上用鈉鹽替代鈣鹽的可行性也有一定的研究[6-8]。本文主要對左亞葉酸鈉注射液的安全性進(jìn)行研究，為臨床用藥安全提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 ES1OK-1電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；ALC1100.2電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；BD115恒溫培養(yǎng)箱(BINDER公司)；80-1電動離心沉淀機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；OLYMPUS-BX41相差顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]；TP1020全自動脫水機(jī)，ST5020全自動染色機(jī)，RM2135切片機(jī)(德國徠卡儀器公司)。

1.2試藥 左亞葉酸鈉注射液(1 mL∶50 mg，以左亞葉酸計，沈陽沃森藥物研究所，批號20130501)；氯化鈉注射液(4.5 g∶500 mL，批號130709A02，雙鶴藥業(yè)沈陽有限責(zé)任公司)；甲醛溶液(500 mL·瓶-1，批號20080922，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；20 mL·L-1雞蛋清溶液(全身主動變態(tài)實驗陽性對照液，臨用現(xiàn)配)。

1.3動物 日本大耳白家兔，雌雄兼用，普通級，體質(zhì)量2.1～2.5 kg；豚鼠，荷蘭種，雌雄兼用，普通級，體質(zhì)量306～368 g，均由沈陽藥科大學(xué)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1血管刺激性實驗 取檢疫合格的家兔4只，左側(cè)耳靜脈注射左亞葉酸鈉注射液50 mg·kg-1，右側(cè)耳靜脈注射同體積氯化鈉注射液，連續(xù)給藥5 d。每天給藥前及末次給藥后48，72和96 h肉眼觀察并記錄動物及注射部位的反應(yīng)。觀察期結(jié)束后處死動物，在兔耳靜脈遠(yuǎn)離注射部位1 cm處剪下長2.5～3.0 cm的組織，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明，肉眼觀察左亞葉酸鈉注射液組血管及周圍組織無刺激性；組織病理學(xué)檢查顯示，兔耳緣靜脈組織結(jié)構(gòu)均正常，血管內(nèi)皮及管壁完整，內(nèi)皮無受損，血管內(nèi)無血栓，血管無破裂，血管周圍組織無水腫、出血和炎性細(xì)胞浸潤等病變，對兔耳緣靜脈無刺激性。肉眼觀察刺激實驗評分標(biāo)準(zhǔn)和光鏡觀察刺激實驗評分標(biāo)準(zhǔn)見表1[9-10]，刺激性實驗結(jié)果見表2。

表1血管刺激性實驗評分標(biāo)準(zhǔn)

Tab.1 Scoring standard of vascular irritation test

觀察指標(biāo)肉眼觀察描述評分光鏡觀察描述評分血管充血正常0內(nèi)皮及管壁完整0充血1內(nèi)皮受損1血管紋路不清2血管內(nèi)血栓2血管呈紫紅色3血管破裂3周圍組織水腫無水腫0正常0輕微水腫1水腫1明顯水腫2出血2嚴(yán)重水腫3炎性細(xì)胞浸潤3壞死4結(jié)果判斷無刺激性≤0.5無刺激性≤0.5輕度刺激性≤2.5輕度刺激性≤2.5中度刺激性≤4.5中度刺激性≤4.5重度刺激性≤6.0重度刺激性≤7.0

表2左亞葉酸鈉注射液血管刺激性實驗結(jié)果

Tab.2 Results of Sodium Levofolinate Injections on vascular irritation test

組別劑量/mg·kg-1肉眼觀察評分48 h72 h96 h光鏡觀察評分氯化鈉注射液-0000左亞葉酸鈉注射液500000

注：-表示只給體積，無劑量。

2.2肌肉刺激性實驗 取檢疫合格的家兔4只，左側(cè)股四頭肌注射左亞葉酸鈉注射液1 mL，右側(cè)注射氯化鈉注射液1 mL。給藥后48 h用動物麻醉機(jī)安樂死處死動物，縱向切開注射部位，肉眼觀察肌肉注射部位有無充血、水腫、變性和壞死等刺激現(xiàn)象。取注射部位肌肉常規(guī)固定、制片，做組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明，肉眼觀察兔肌肉給藥部位無明顯變化。組織病理學(xué)檢查顯示，左亞葉酸鈉注射液組肌肉橫紋清晰細(xì)胞核位于肌纖維周邊，肌間無出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤和壞死等病變，對兔股四頭肌未見明顯刺激性。肉眼觀察肌肉刺激評分標(biāo)準(zhǔn)和光鏡觀察肌肉刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)見表3，4塊股四頭肌反應(yīng)評分的總和，若各股四頭肌反應(yīng)評分的最高與最低之差小于2時，認(rèn)為受試物對肌肉無明顯刺激性。若各股四頭肌反應(yīng)評分的最高與最低之差大于2時，應(yīng)另取2只動物重新實驗，如重新實驗超過2分則認(rèn)為受試物對肌肉存在明顯刺激性，不可供肌肉注射用[11]。結(jié)果見表4。

表3肌肉刺激性實驗評分標(biāo)準(zhǔn)

Tab.3 Scoring standard of muscle irritation test

肉眼觀察觀察指標(biāo)評分光鏡觀察刺激反應(yīng)評分無明顯變化0無明顯變化0輕度充血,范圍在0.5 cm×1.0 cm以下1股四頭肌間質(zhì)水腫1中度充血,范圍在0.5 cm×1.0 cm以上2股四頭肌間質(zhì)出血2重度充血,伴有肌肉變性3股四頭肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤3出現(xiàn)壞死,有褐色變性4股四頭肌壞死4出現(xiàn)廣泛性壞死5

表4左亞葉酸鈉注射液肌肉刺激性實驗結(jié)果

Tab.4 Results of Sodium Levofolinate Injections on muscle irritation test

組別劑量/mg·kg-1肉眼觀察評分光鏡觀察評分氯化鈉注射液-00左亞葉酸鈉注射液5000

注：-表示只給體積，無劑量。

2.3全身主動變態(tài)實驗 取檢疫合格的豚鼠24只，按照體質(zhì)量隨機(jī)均分為4組，分別為左亞葉酸鈉注射液高劑量組(50 mg·kg-1)、低劑量組(13 mg·kg-1，臨床等效劑量)、陽性對照組(20 mL·L-1雞蛋清溶液)及陰性對照組(氯化鈉注射液)。分別腹腔注射左亞葉酸鈉注射液0.5 mL，隔日致敏，連續(xù)5次。末次致敏后第14天，各組分別靜脈注射上述藥液的激發(fā)液1.0 mL，觀察記錄給藥后30 min(低劑量組由于30 min時仍有癥狀出現(xiàn)，故觀察時間延長至1 h)內(nèi)動物有無豎毛、抽搐、呼吸困難、休克和死亡等變態(tài)反應(yīng)癥狀、癥狀的出現(xiàn)時間及消失時間。判斷變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生程度，計算變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率。結(jié)果表明，靜脈注射激發(fā)后觀察，陰性對照組全部均未見變態(tài)反應(yīng)癥狀(發(fā)生率為0%)，評價為變態(tài)反應(yīng)陰性；陽性對照組全部立即出現(xiàn)呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍和死亡等變態(tài)反應(yīng)癥狀，4 min內(nèi)6只動物全部死亡(發(fā)生率為100%)，屬變態(tài)反應(yīng)極強(qiáng)陽性；左亞葉酸鈉高劑量組3只動物5～24 min內(nèi)出現(xiàn)搔鼻、噴嚏和咳嗽等癥狀(發(fā)生率為50%)，屬變態(tài)反應(yīng)陽性。左亞葉酸鈉低劑量組3只動物12～41 min內(nèi)出現(xiàn)顫抖、搔鼻、噴嚏、咳嗽、排便和流淚等癥狀(發(fā)生率為50%)，屬變態(tài)反應(yīng)陽性。全身主動變態(tài)反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)見表5[12]，結(jié)果見表6。

表5全身主動變態(tài)反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)

Tab.5 Standard of valuation of active systemic anaphylaxis test

癥狀反應(yīng)分級癥狀反應(yīng)分級癥狀反應(yīng)分級正常-呼吸急促++步態(tài)不穩(wěn)+++躁動+排尿++跳躍+++豎毛+排糞++喘息+++顫抖+流淚++痙攣+++搔鼻+呼吸困難+++旋轉(zhuǎn)+++噴嚏++哮鳴音+++潮式呼吸+++咳嗽++紫癜+++死亡++++

表6左亞葉酸鈉注射液全身主動變態(tài)實驗結(jié)果

Tab.6 Results of Sodium Levofolinate Injections on active systemic anaphylaxis

組別每只動物反應(yīng)程度123456變態(tài)率/%陰性對照組------0左亞葉酸鈉高劑量組++--++++-50左亞葉酸鈉低劑量組--++++++-50陽性對照組++++++++++++++++++++++++100

2.4溶血與凝聚實驗 取檢疫合格的健康家兔1只，心臟采血10 mL，玻璃珠振搖除纖維蛋白原，使成脫纖血。用氯化鈉注射液洗滌，離心(1 500 r·min-1，15 min)，反復(fù)3次至上清液不顯紅色，沉淀的紅細(xì)胞按照體積比用氯化鈉注射液配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞混懸液。取潔凈試管9支，1～6號管為左亞葉酸鈉實驗管，7號管為陰性對照管，8號管為陽性對照管，9號管為左亞葉酸鈉對照管。見表7。按照表7[13-14]所示，依次加入不同體積的左亞葉酸鈉注射液、氯化鈉注射液、純化水及體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液，混勻，置于培養(yǎng)箱中37±0.5 ℃溫育。觀察各管在0.25，0.5，0.75，1，2和3 h是否有溶血與凝聚現(xiàn)象。結(jié)果表明，3 h內(nèi)陰性對照管上層溶液呈無色透明，紅細(xì)胞全部下沉，未見溶血現(xiàn)象，陽性對照組各管溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留，完全溶血。左亞葉酸鈉注射液各管在3 h內(nèi)紅細(xì)胞全部下沉，未見紅棕色絮狀沉淀，上層溶液澄清無色，無溶血及凝聚現(xiàn)象。對紅細(xì)胞是否產(chǎn)生溶血及凝聚作用判斷標(biāo)準(zhǔn)見表8[15]，結(jié)果見表9。

表7溶血與凝聚實驗加樣體積

Tab.7 Test volume in hemolysis and coagulation test

名稱各管加液體積/mL1234567892%紅細(xì)胞混懸液2.52.52.52.52.52.52.52.5氯化鈉注射液2.42.32.22.12.02.52.5純化水2.5左亞葉酸鈉注射液0.10.20.30.40.52.52.5

表8溶血與凝聚實驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

Tab.8 The standard of hemolysis and coagulation test

現(xiàn)象評價溶液呈澄明紅色,管底無細(xì)胞殘留全溶血溶液呈澄明紅色或棕色,管底有少量紅細(xì)胞殘留部分溶血紅細(xì)胞全部下沉,上層液體無色澄明無溶血溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀,振搖后不分散凝聚

表9左亞葉酸鈉注射液溶血與凝聚結(jié)果

Tab.9 Results of Sodium Levofolinate Injections on hemolysis and coagulation test

時間/h管號1234567890.25-------±/0.50-------+/0.75-------+/1-------+/2-------+/3-------+/凝聚-------//

注：+表示全溶血，-表示無溶血或無凝聚現(xiàn)象，±表示部分溶血，/表示無需觀察溶血或凝聚現(xiàn)象。

3 討論

在本實驗條件下，左亞葉酸鈉注射液對兔耳緣靜脈、股四頭肌均無刺激作用，對兔血紅細(xì)胞無體外溶血與凝聚作用。全身主動變態(tài)實驗是通過觀察抗原與IgE抗體結(jié)合后導(dǎo)致肥大細(xì)胞、嗜堿性脫顆粒、釋放活性介質(zhì)而導(dǎo)致的全身性變態(tài)反應(yīng)，該實驗?zāi)康氖菫榱擞^察受試物經(jīng)全身給藥后對動物引起的變態(tài)反應(yīng)，而非為了檢驗供試品對動物產(chǎn)生的毒性積累作用[16-17]，因此本實驗設(shè)置左亞葉酸鈉高和低2個劑量組以觀察受試物在不同質(zhì)量濃度時引起的變態(tài)反應(yīng)是否相同。左亞葉酸鈉注射液對豚鼠全身主動變態(tài)反應(yīng)呈陽性，但低劑量組(臨床等效劑量)的陽性反應(yīng)均為噴嚏、咳嗽等并不嚴(yán)重的現(xiàn)象，反應(yīng)出現(xiàn)的時間較晚，且尚未見到臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)報道，因此可判斷其全身主動變態(tài)反應(yīng)并不嚴(yán)重。亞葉酸鈣臨床偶見皮疹、蕁麻疹或哮喘等變態(tài)反應(yīng)[18]，左亞葉酸鈉出現(xiàn)與亞葉酸鈣類似的變態(tài)反應(yīng)也有可能。左亞葉酸鈉注射液的主要雜質(zhì)為7-羥基-8-氫葉酸和10-甲酰葉酸，其中10-甲酰葉酸結(jié)構(gòu)收錄于歐洲藥典中[19]。由此可見，左亞葉酸鈉注射液在本實驗條件下，基本符合注射劑的安全要求，但臨床應(yīng)用時應(yīng)密切關(guān)注其變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。