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      HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中5種木脂素類成分的含量

      2018-09-18 08:40:56吳浩善張冬月虞小靜李思雨張慧
      關(guān)鍵詞:木脂素高效液相色譜含量測(cè)定

      吳浩善 張冬月 虞小靜 李思雨 張慧

      【摘 要】 目的:利用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中5種木脂素類成分的含量,并比較其差異。方法:采用菲羅門XB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0~10min,A為50%;10~15min,A為50%~75%;15~25min,A為75%;25~30min,A為75%~50%);檢測(cè)波長:217nm;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:10μL。結(jié)果:5種木脂素類成分與相鄰組分分離度均大于1.5,方法學(xué)考察結(jié)果均符合有關(guān)規(guī)定。結(jié)論:不同產(chǎn)地五味子中木脂素類成分含量存在較大程度的差異,建立的HPLC方法能夠同時(shí)測(cè)定五味子藥材中的5種成分的含量,可用于五味子藥材及其制劑中木脂素類成分的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

      【關(guān)鍵詞】 五味子;不同產(chǎn)地;木脂素;含量測(cè)定;高效液相色譜

      【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517(2018)05-0009-05

      Abstract: Objective To determine the contents of five lignans in Schisandra chinensis (Turcz.) Baill,and compare the differences among different habitats. Methods Phenomenex XB-C18 column ( 4.6mm × 250mm,5μm) was used. Acetonitrile( A) -water( B) was used as gradient mobile phase(0~10min,50% A;10~15min,50%~75% A;15~25min,75% A;25~30min,75%~50% A) . The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 217nm and the column temperature was 30℃. Results Chromatographic separation is greater than 1.5, the results of the methodology are consistent with the relevant regulations. Conclusion The HPLC method developed for simultaneous determination of 5 lignans is simple and valid. It can be used for quality evaluation and quality control of Schisandra chinensis ( Turcz. ) Baill, which can be used in the determination and quality control of the content of lignans in the medicine and its preparation.

      Keywords:Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.;Different Habitats;Lignans;Content Determination;High Performance Liquid Chromatography

      五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果實(shí),主產(chǎn)于遼寧省,吉林、黑龍江產(chǎn)量也相對(duì)較大,臨床用于治療久咳虛喘、心悸失眠、盜汗、津傷口渴等癥[1]。木脂素類化合物是五味子中含量較高且具有顯著生物活性的成分[2],藥理作用顯著,其單體和總木脂素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于在對(duì)抗炎癥[3]、肝損傷修復(fù)[4]、腫瘤的預(yù)防和治療[5]等方面。本研究建立HPLC同步測(cè)定5種木脂素類化合物含量的分析方法,對(duì)五味子藥材的質(zhì)量進(jìn)行了分析與評(píng)價(jià),以期為五味子藥材及復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)管提供一定的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

      1 儀器與材料

      1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司);AR2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司);METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士);FW-80 型粉碎機(jī);KQ-250D型數(shù)控超聲波清洗器。

      1.2 材料 五味子藥材共29批,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張慧教授鑒定,均為正品,藥材具體信息見表1。甲醇為分析純;乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水。五味子醇甲(批號(hào):Y17M8H31887)、五味子醇乙(批號(hào):P28S6F3984)、五味子甲素(批號(hào):Z23J7B16583)、五味子乙素(批號(hào):P25M7F11829)、五味子丙素(批號(hào):P28J8F36961)等均購自上海源葉生物科技有限公司,純度均≥98%。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 色譜條件 色譜柱:菲羅門XB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脫條件為0~10min,A為50%;10~15min,A為50%~75%;15~25min,A為75%;25~30min,A為75%~50%。流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長:217nm;進(jìn)樣體積:10μL;柱溫:30℃,色譜圖如圖1~2所示。

      2. 2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取各對(duì)照品適量,甲醇超聲溶解,得對(duì)照品濃溶液。精密吸取一定量的各對(duì)照品濃溶液,加甲醇稀釋成含五味子醇甲(0.2048mg/mL)、五味子醇乙(0.0493mg/mL)、五味子甲素(0.0984mg/mL)、五味子乙素(0.0463mg/mL)、五味子丙素(0.01056mg/mL)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,備用。

      2.3 供試品溶液制備 五味子藥材粉碎,過50目篩,取粉末約0.5g,精密稱定,置50mL具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱定重量,超聲處理30min,拭干錐形瓶表面放涼,稱重,甲醇補(bǔ)足減失的重量,靜置,取上清液,以0.45μm微孔濾膜過濾,即得。

      2.4 方法學(xué)考察

      2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.25、0.5、0.75、1mL,置1mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,精密吸取各混合對(duì)照品稀釋液及各單個(gè)對(duì)照品溶液(樣品中5種木脂素類化合物含量差異懸殊,僅以稀釋后的混合對(duì)照品溶液無法滿足整個(gè)線性范圍,因此各成分的最高濃度采用單標(biāo)試驗(yàn))各10μL,注入液相色譜儀,檢測(cè),以對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。具體見表2。

      2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10μL,依色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)峰面積,計(jì)算得5種木脂素類成分的RSD分別為0.95%、0.64%、0.79%、1.6%和1.2%,符合規(guī)定,儀器精密度良好。

      2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次五味子藥材粉末6份(遼寧1批),各約0.5g,精密稱定,按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,依色譜條件進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)5種木脂素類化合物的峰面積,計(jì)算其在樣品中含量的RSD,分別為1.43%、0.52%、1.24%、1.85%、2.1%,表明該方法重復(fù)性良好。

      2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取五味子藥材粉末(遼寧1批)約0.5g,精密稱定,按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,依色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別于0、2、4、6、8、12h各進(jìn)樣10μL,得峰面積,并計(jì)算各成分峰面積的RSD,分別為0.27 %、1.35 %、0.8%、1.64%、2.2%,說明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定,滿足含量測(cè)定要求。

      2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批五味子藥材粉末(遼寧1批)約0.25g,精密稱定,共6份,分別加入對(duì)照品適量,依法制備供試品溶液,依色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算5種成分的平均回收率及RSD,結(jié)果顯示,5種木脂素類成分的平均加樣回收率均在99%~100%之間,RSD均小于2%,符合相關(guān)規(guī)定,表明方法的準(zhǔn)確度良好。具體見表3。

      2.5 樣品含量測(cè)定 取各批次的五味子藥材(過50目篩)約0.5g,精密稱定,各2份,依法制備供試品溶液,依色譜條件進(jìn)行測(cè)定,得各化合物的峰面積,根據(jù)外標(biāo)法中的線性回歸方程方法計(jì)算樣品中5種木脂素類成分含量。結(jié)果見表4。

      3 討論

      本實(shí)驗(yàn)對(duì)多個(gè)色譜條件進(jìn)行考察,包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水,3種梯度洗脫的流動(dòng)相條件,最終確定乙腈-水的梯度洗脫為本實(shí)驗(yàn)選擇的色譜條件,主要優(yōu)點(diǎn)是在該色譜條件下樣品中各被測(cè)成分的色譜峰與相鄰成分均實(shí)現(xiàn)基線分離,色譜峰對(duì)稱性良好,且分析時(shí)間快,僅需30min就可以完成整個(gè)含量測(cè)定過程。同時(shí)也考察了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)、不同檢測(cè)波長(217nm、254nm)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明柱溫對(duì)待測(cè)成分的色譜峰的分離度有影響,當(dāng)柱溫為30℃時(shí),分離度最佳;以254nm作為檢測(cè)波長時(shí),各色譜峰峰形變差,且因各批次藥材中五味子丙素含量均較低,紫外吸收弱,色譜峰響應(yīng)效果不理想,故選擇色譜峰響應(yīng)效果、峰形均良好的217nm作為檢測(cè)波長。

      在前期材料的準(zhǔn)備過程中,藥材均產(chǎn)自五味子的主要產(chǎn)區(qū):遼寧、吉林、黑龍江,29批藥材大部分均收集自東北地區(qū)具有代表性的沈陽、哈爾濱的藥材市場(chǎng),以及在全國具有知名度的亳州、安國藥材市場(chǎng),既確保了藥材產(chǎn)地的道地性和科學(xué)性,又收集了足夠多的樣品,確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)、可靠、有代表性。同時(shí)對(duì)五味子藥材的產(chǎn)地加工、倉儲(chǔ)以及非產(chǎn)地加工、倉儲(chǔ)對(duì)藥材質(zhì)量的影響進(jìn)行了初步探索,并提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

      從表2中可以看出絕大部分樣品中五味子醇甲的含量均≥4mg/g,符合藥典要求,但是在遼寧、吉林、黑龍江各批次當(dāng)中各有1批、1批、2批藥材的五味子醇甲含量未達(dá)到藥典要求,對(duì)這4批藥材研究發(fā)現(xiàn),藥材生產(chǎn)日期均明顯早于其它批次,藥材市場(chǎng)及飲片加工企業(yè)在五味子藥材儲(chǔ)藏過程中,出于成本的考慮,倉儲(chǔ)條件可能無法達(dá)到國家規(guī)定,隨著倉儲(chǔ)時(shí)間的延長,五味子藥材受溫度、濕度及蟲蛀的影響,藥材質(zhì)量會(huì)變差[6],木脂素類成分含量會(huì)逐漸降低,因此應(yīng)當(dāng)避免使用放置時(shí)間過久的陳品,這也是醫(yī)院、藥房以及制藥企業(yè)采購五味子時(shí)需要特別關(guān)注的問題。

      五味子是遼寧省的道地藥材,又稱“遼五味”,含量測(cè)定結(jié)果也在一定程度上說明了這一點(diǎn),29批樣品中,總木脂素含量最高為13.98mg/g,產(chǎn)自遼寧,且遼寧各批次木脂素含量整體均較高,優(yōu)于吉林、黑龍江產(chǎn)區(qū)的五味子。此外從表4中可以看出,五味子醇甲雖然在5種木脂素類化合物中含量最高,但是另外幾種木脂素類成分的含量也較高,比如五味子醇乙、五味子乙素,其中五味子乙素具有顯著的生物活性,在臨床上應(yīng)用廣泛[7-8]。這說明單純以五味子醇甲的含量來評(píng)價(jià)五味子藥材及制劑的質(zhì)量有所欠缺,應(yīng)該嘗試以多種指標(biāo)綜合評(píng)價(jià),本實(shí)驗(yàn)為評(píng)價(jià)五味子中的木脂素類成分提供了一種快速、可靠、科學(xué)的檢測(cè)方法。

      參考文獻(xiàn)

      [1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:66.

      [2]劉宇靈,付賽,樊麗姣,等.南北五味子化學(xué)成分、藥理作用等方面差異的研究進(jìn)展[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2017,23(12):228-234.

      [3]邱宏濤,趙筱萍,李正,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的五味子木脂素類主要藥效作用研究[J]. 中國中藥雜志,2015,40(3):522-527.

      [4]陶小芳,宿樹蘭,江署,等.五味子藥渣提取物中木脂素類成分分析及其對(duì)急性肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用[J]. 中草藥,2016,47(17):3051-3057.

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      [6]拱健婷. 易變質(zhì)中藥加速試驗(yàn)方法研究與質(zhì)量預(yù)測(cè)模型的建立[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2017.

      [7]遲德彪. 五味子乙素對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2008.

      [8]劉振. 五味子乙素抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)體外研究[D].杭州:浙江大學(xué),2011.

      (收稿日期:2018-07-05 編輯:程鵬飛)

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