陰炎凈洗液HPLC—DAD雙波長指紋圖譜研究

田霞 肖作奇 黃懿 潘濤 歐陽波

[摘要] 目的 建立陰炎凈洗液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法。 方法 依利特ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，柱溫為25℃，檢測波長選擇210 nm和280 nm。 結果 建立了陰炎凈的HPLC指紋圖譜，標示出33個共有色譜峰，同時對其中5個色譜峰進行歸屬。 結論 雙波長指紋圖譜實現(xiàn)了較為全面的評價，建立的方法靈敏、準確、簡單，分離效果好，可作為陰炎凈洗液質(zhì)量評價的方法。

[關鍵詞] 陰炎凈洗液；指紋圖譜；高效液相色譜；質(zhì)量控制

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0027-05

[Abstract] Objective To establish fingerprint methods in Yinyanjing Lotion by high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods A Hypersil ODS2 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the flow rate was 1.0 mL/min. The mobile phase was acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution with gradient elution at 25℃. The flow-rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 210 nm and 280 nm. Results The common modes for the HPLC fingerprints were set up by ensuring 33 common peaks in the chromatograms. 5 chemical constituents were analyzed qualitatively. Conclusion Dual-wavelength chromatographic fingerprint can realize the analysis of a formula as a whole. This method is sensitive， accurate and simple， and can be used for the quality control of Yinyanjing Lotion.

[Key words] Yinyanjing Lotion； Fingerprint； High performance liquid chromatography； Quality control

陰炎凈洗液是湖南省婦幼保健院臨床使用20余年的婦科洗液，由苦參、黃連、連翹、蛇床子等九味中藥組成，有殺菌、止癢等功效，臨床將其用于婦科陰道炎、宮頸炎等疾病的輔助治療[1]。處方中苦參所含的苦參堿和氧化苦參堿具有很好的抗菌、消炎作用[2-5]；黃連中小檗堿也是公認的抑菌有效成分[6-7]；連翹苷是消炎的主要有效成分[8-9]；蛇床子素有祛濕殺蟲的療效[10-11]。這些化學成分是陰炎凈常用的質(zhì)量控制指標，前期研究中，本研究僅對其中一個或兩個成分含量進行控制[12-14]，但中藥復方成分復雜，一個或兩個成分的測定不能反映該方的整體藥效，指紋圖譜技術是對該方的全成分進行測定，可提高對該方質(zhì)量的控制。

文獻和實驗研究結果表明，方中苦參堿和氧化苦參堿僅在低于230 nm波長處有吸收值，而低波長范圍內(nèi)高效液相色譜（HPLC）圖的基線容易漂移，所以單波長難以實現(xiàn)對方中的成分進行全面測定和評價。參照相關文獻報道[15-20]，本研究選用二極管陣列檢測器（DAD）進行檢測，選用兩個波長融合后的指紋圖譜對陰炎凈洗液進行質(zhì)量評價。

1 儀器與材料

電子分析天平（德國，Mettler Toledo XS205型，精度0.1 mg）；電子天平（日本，X4205型）；0.22 μm微孔濾膜（美國，密理博）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進）；超聲清洗器（上海科導，HS-2060）；高效液相色譜儀（日本島津公司，LC-20A型）；二極管陣列檢測器（島津，SPD-M20A）；柱溫箱（島津，CTO-10AS）；色譜柱（Hypersil ODS2，5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。小檗堿對照品（110713-200911）、苦參堿對照品（110805-200306）、氧化苦參堿（110780-201007）、連翹苷（110821-201213）和蛇床子素對照品（0822-200204）均來源于中國食品藥品檢定研究院。陰炎凈洗液（批號：141015、141016、141017、141018、141028、141029、141030、141104、141105、141106）由湖南省婦幼保健院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Hypersil ODS2色譜柱，流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序見表1。檢測波長為200～400 nm，流動相流速1.0 mL/min，柱溫為25℃，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液配制

分別精密稱取小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿、蛇床子素和連翹苷適量，用甲醇分別配制成濃度為0.672、1.213、0.694、1.648、0.896 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得對照品溶液。取各對照品溶液200 μL混合均勻，制得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取陰炎凈洗液20.0 mL，置100 mL容量瓶中，加入乙醇定容，搖勻，取中間層溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 精密度試驗及參照峰的選擇

取供試品溶液（批號：141015），按“2.1”項下條件連續(xù)進樣6次進行測定?？疾旄鞴灿蟹宓南鄬ΡＡ魰r間和相對峰面積，結果所有共有峰相對保留時間均相對標準差（RSD）≤1.96%，共有峰相對峰面積值均RSD≤1.92%，提示該方法精密度良好。30號峰峰面積最大，因此將其選為本研究的參照色譜峰。

2.5 重復性試驗

按“2.3”項下供試品溶液制備方法，取同一批陰炎凈洗液（批號：141015）平行制備6次，按“2.1”項下條件分別進樣測定。結果各共有峰相對保留時間均RSD≤1.76%，峰面積值均RSD≤2.19%，提示方法重復性好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：141015），按“2.1”項下條件于0、2、4、6、12、24 h分別測定1次，共測6次，考察各共有峰的相對保留時間和峰面積值，結果各共有峰相對保留時間均RSD≤2.34%，峰面積值均RSD≤2.19%，提示供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 指紋圖譜的建立

分別取10批次不同批號的陰炎凈洗液，按“2.1”項下條件分別測定。從島津LC-solution工作站中分別導出10批次陰炎凈洗液在210 nm（圖1A）處和280 nm（圖1B）的色譜圖，再導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的操作規(guī)范軟件（版本2004A）中，分別導出色譜圖txt文件，0～30 min選擇210 nm數(shù)據(jù)，30～120 min選擇280 nm數(shù)據(jù)，將兩個時間段內(nèi)數(shù)據(jù)合并得到每批次陰炎凈洗液雙波長融合指紋圖譜（圖1C）。將10批次陰炎凈洗液雙波長融合指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的操作規(guī)范軟件（版本2004A），進行多點校正后，然后匹配生成對照指紋圖譜（圖2），共確定33個共有峰，每批次陰炎凈洗液與對照指紋圖譜比較相似度均>0.988（表2），批次之間差異>0.964。

2.8 與對照品對照確定峰歸屬

各對照品溶液和混合對照品溶液的分析結果見圖3?？鄥A和氧化苦參堿在280 nm的色譜圖中沒有色譜峰出現(xiàn)，雙波長融合后5中對照物質(zhì)的色譜峰均能得到有效的體現(xiàn)。結果表明，陰炎凈洗液色譜圖中的5號峰為苦參堿，6號峰為氧化苦參堿，25號峰為連翹苷，30號峰為小檗堿，32號峰為蛇床子素。

3 討論

本研究選用HPLC-DAD對陰炎凈洗液的全成分指紋圖譜進行研究，研究結果表明，單波長280 nm各成分之間分離較好，有較多成分能得到體現(xiàn)，但是方中的主要活性成分苦參堿和氧化苦參堿的色譜峰峰高很低，難以體現(xiàn)；在單波長210 nm處，苦參堿和氧化苦參堿有較大的峰高值，其中9、10號峰也能較好地分離，但是30～60 min內(nèi)的成分分離較差，且100 min后有嚴重的信號漂移，蛇床子素的色譜峰得不到體現(xiàn)；綜合考慮選用雙波長融合法對陰炎凈洗液的指紋圖譜進行研究。

陰炎凈洗液的化學成分復雜，該方法得到了33個共有色譜峰。文獻檢索結果[2-11]表明，苦參堿、氧化苦參堿、連翹苷、小檗堿和蛇床子素等5種成分為該制劑主要抗菌、抗炎成分，由此，本研究對這5種成分對應的色譜峰進行了指認。該方法精密度、重復性、穩(wěn)定性等均符合要求，能全面地評價陰炎凈洗液的質(zhì)量。本研究尚處于初步階段，指紋圖譜與藥材和相關性有待進一步研究。

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