CCK—8法在淋巴細(xì)胞增殖檢測中最佳實驗條件的篩選

王瑾 馬肖容 張王剛

[摘要] 目的 篩選CCK-8法在淋巴細(xì)胞增殖檢測中的最佳實驗條件。 方法 采用正交實驗設(shè)計，對初始細(xì)胞濃度、培養(yǎng)時間、LPS濃度、顯色時間這4個主要因素各水平對人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）和小鼠脾細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行試驗研究，對各實驗組合測得的刺激指數(shù)進(jìn)行方差分析。 結(jié)果 CCK-8檢測人PBMC增殖試驗的最佳條件：初始細(xì)胞濃度為2.5×106/mL，培養(yǎng)時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；檢測小鼠脾細(xì)胞增殖試驗的最佳條件：初始細(xì)胞濃度為5.0×106/mL，培養(yǎng)時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。 結(jié)論 CCK-8法便捷、靈敏、重復(fù)性好，可作為檢測淋巴細(xì)胞增殖的穩(wěn)定方法。本研究建立的CCK-8最佳實驗條件可為免疫調(diào)節(jié)作用的藥物體外篩選和免疫藥理學(xué)作用的研究提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] CCK-8；PBMC；淋巴細(xì)胞增殖；正交實驗

[中圖分類號] R392.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（b）-0013-04

[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density， culture period， concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8） on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOVA was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows： for PBMC， cell density was 2.5×106/mL， culture period was 48 h， concentration of LPS was 1 μg/mL， and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h； and for splenocyte， cell density was 5.0×106/mL， culture period was 48 h， concentration of LPS was 1 μg/mL， and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive， convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.

[Key words] CCK-8； PBMC； Lymphocyte proliferation； Orthogonal test

檢測淋巴細(xì)胞增殖的方法主要有形態(tài)學(xué)檢查法、放射性核素標(biāo)記法和四氮唑鹽比色法等。形態(tài)學(xué)檢查法和放射性核素標(biāo)記法因多方面原因應(yīng)用有限。MTT比色法以其快速簡便、靈敏度高、無放射性污染等特點，已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域分析細(xì)胞生長、活性的基本方法[1]。但其形成的甲臜結(jié)晶（Formazan）不溶于水，需加有機溶劑溶解，重復(fù)性不佳。近年來國外開發(fā)了多種水溶性的四氮唑鹽類，如MTS[2]、XTT和WST-8[3-4]等。CCK-8試劑中含有的WST-8可被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臢，減少了實驗步驟，提高了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。生成的甲臢數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用于分析細(xì)胞增殖和活性[6-7]。本研究采用正交實驗設(shè)計對CCK-8檢測法的實驗條件進(jìn)行探討，以期建立人外周血單個核細(xì)胞（human peripheral blood mononuclear cells，PBMC）和小鼠脾細(xì)胞增殖的最佳實驗條件，為后期相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)，為生物活性藥物的體外篩選提供可靠的篩選體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和動物 Balb/c小鼠，雌性，6周齡，（20±2）g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。健康人外周血，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院中國人民解放軍西安血站提供。

1.1.2 試劑 CCK-8（Cell Counting Kit-8，日本Donjindo），淋巴細(xì)胞分離液（天津TBD），LPS（Sigma），96孔板（Costar），RPMI 1640培養(yǎng)基（Sigma）；青、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青）等。

1.1.3 儀器 全自動酶聯(lián)免疫分析儀（德國BMG Labtechnologies公司），移液器（美國Gilson公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱BB16型（德國Heraeus公司），離心機LG15-W型（北京醫(yī)用離心機廠），電子天平AB104-N型（梅特勒-托利多儀器有限公司），超凈工作臺（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人外周血PBMC的分離 以密度梯度離心法分離人外周血PBMC。將淋巴細(xì)胞分離液和抗凝血按照1：1的比例先后加入離心管，保持界面清晰。2000 r/min離心20 min。小心吸取血漿和淋巴細(xì)胞分離液界面處單個核細(xì)胞形成的云霧層。PBS洗滌3遍，臺盼蘭染色計數(shù)，細(xì)胞活力﹥95%。

1.2.2 小鼠脾細(xì)胞的分離 頸椎脫位法處死小鼠，無菌條件下取脾臟，置于盛有RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。用眼科剪將脾臟剪成小段，置于200目不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯輕壓使細(xì)胞通過制成脾細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾。臺盼蘭染色，細(xì)胞活力﹥95%。

1.2.3 實驗設(shè)計 采用正交實驗設(shè)計方法（表1）。各因素分別為：A-初始細(xì)胞濃度（×106/mL）；B-培養(yǎng)時間（h）；C-LPS濃度（μg/mL），D-加入CCK-8后的顯色時間（h）。其中A因素有4個水平，B、C、D因素各有3個水平。用SPSS 20.0設(shè)計L16（41×33）混合正交表（表2～3），觀察指標(biāo)為刺激指數(shù)（SI）。按照表2的試驗安排篩選CCK-8檢測人PBMC增殖試驗最佳條件；按照表3篩選CCK-8檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗的最佳條件。

1.2.4 淋巴細(xì)胞增殖實驗 調(diào)節(jié)人PBMC或小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液終濃度為1×106、2.5×106、5×106、1×107/mL；將細(xì)胞懸液加至96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)6個平行孔；再按照試驗安排加入LPS，20 μL/孔，終濃度分別為0.1、1.0、10 μg/mL，PBS為對照。每孔再加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液80 μL，終體積為200 μL。37℃，5%CO2，分別培養(yǎng)24、48、72 h。分別在在培養(yǎng)結(jié)束前3、4.5、6 h加入CCK-8，20 μL/孔[8]，繼續(xù)培養(yǎng)至終點。以空白孔調(diào)零（相同培養(yǎng)液200 μL+CCK-8 20 μL），上機檢測吸光度（A450/620），按下列公式計算刺激指數(shù)SI。上述實驗重復(fù)進(jìn)行3次，計算。

SI=刺激孔A值/對照孔A值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，刺激指數(shù)用x±s表示。正交設(shè)計采用單變量方差分析，驗證實驗采用t檢驗進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 正交實驗結(jié)果

初始細(xì)胞濃度、培養(yǎng)時間、LPS濃度、加入CCK-8后孵育的時間4個因素對人PBMC和小鼠脾細(xì)胞增殖均有顯著影響（P < 0.01）。由極差進(jìn)行直觀分析，在人PBMC增殖試驗中，各因素的重要性順序為C>A>B>D。通過比較各水平k值大小，各因素的最優(yōu)水平為A2、B2、C2、D2，最優(yōu)組合為：A2B2C2D2，即初始細(xì)胞濃度為2.5×106/mL，培養(yǎng)時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h是CCK-8檢測人PBMC增殖試驗的最佳條件，即表2中的3號試驗。同理在小鼠脾細(xì)胞增殖試驗中各因素對試驗結(jié)果影響程度的順序為C>A>B>D，最佳條件組合為A3B2C2D2，即初始細(xì)胞濃度為5.0×106/mL，培養(yǎng)時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。但該組合并未包括在正交表中進(jìn)行試驗，故對該條件組合進(jìn)行驗證試驗。見表4、5。

2.2 驗證試驗

A3B2C2D2組合滿足試驗要求（P < 0.05）。即初始細(xì)胞濃度為5.0×106/mL，培養(yǎng)時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h，是CCK-8檢測小鼠脾細(xì)胞增殖實驗的最佳條件。見表6。

3 討論

淋巴細(xì)胞在絲裂原作用下的可發(fā)生增殖和分化，是機體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的一個基本指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于生物活性因子的活性檢測、高通量藥物篩選等領(lǐng)域。PBMC和小鼠脾淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞增殖實驗中最常用的兩種細(xì)胞。檢測淋巴細(xì)胞增殖的方法有形態(tài)學(xué)檢查法、單細(xì)胞克隆法，檢測DNA合成含量的放射性核素標(biāo)記法和檢測細(xì)胞代謝活性的比色法等。形態(tài)學(xué)檢查法存在人工計數(shù)的主觀差異，以3H-TdR摻入法為代表的放射性核素標(biāo)記法比形態(tài)學(xué)檢查法更客觀、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，但存在放射性污染可能，需要特殊的儀器設(shè)備。因此，3H-TdR摻入法雖然敏感，但其應(yīng)用仍然有限。而四甲基偶氮唑鹽MTT比色法快速簡便，靈敏度高、不需要特殊檢測儀器、無放射性污染、適合大批量檢測，在生物活性因子的檢測[9]、細(xì)胞毒性試驗[10]、抗腫瘤藥物篩選[11]以及腫瘤細(xì)胞藥敏檢測[12]等方面廣泛應(yīng)用。但MTT法形成的藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶不溶于水，不能直接測量吸光度，要棄去上清后加二甲基亞砜溶解。由于在吸取上清液時有可能帶走小部分的甲臜，影響測量結(jié)果，故重復(fù)性不佳。CCK-8法與MTT法具有相似的實驗機制，而且避免了二甲基亞砜對細(xì)胞的毒性作用[11]。CCK-8試劑中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，簡稱為WST-8。它在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為黃色甲臢產(chǎn)物，具高度水溶性，可直接測量，簡化了實驗操作步驟，重復(fù)性優(yōu)于MTT法，實驗結(jié)果更準(zhǔn)確，在檢測細(xì)胞增殖[14-15]、細(xì)胞毒性實驗[16]、藥物篩選[17]以及腫瘤藥敏試驗[18]中都可應(yīng)用。但與MTT相比，CCK-8試劑要昂貴許多[19]。1982年Gratzer制備出抗溴脫氧尿嘧啶核苷BrdU單抗[20]。近年來非放射性標(biāo)志物的研究發(fā)展迅速，標(biāo)記檢測技術(shù)不斷改良提高，應(yīng)用BrdU標(biāo)記的敏感性已與3H-TdR相似[21]。目前認(rèn)為BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標(biāo)志物之一。

本研究分別探討了在人PBMC和小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖中CCK-8檢測法各自最佳的實驗條件。它們最適的初始細(xì)胞濃度分別為2.5×106/mL和5.0×106/mL。最佳培養(yǎng)時間均為48 h。LPS濃度的研究中，1 μg/mL的濃度最適宜，濃度過低不足以刺激淋巴細(xì)胞最大程度地增殖，濃度過高（10 μg/mL）則抑制了細(xì)胞的增殖（SI<1）。關(guān)于加入CCK-8后孵育時間的長短，因血液細(xì)胞形成的甲臢很少，資料推薦較長的孵育時間（5～6 h）使顯色充分。但本實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孵育時間達(dá)到6 h時空白孔吸光度增加，部分細(xì)胞數(shù)較高的孔吸光度已接近酶標(biāo)儀讀數(shù)的上限，影響實驗的準(zhǔn)確性。在上述細(xì)胞濃度下，顯色4.5 h已經(jīng)比較充分，此時空白孔吸收較小，準(zhǔn)確度高，故實驗中選擇4.5 h作為最佳孵育時間。

綜上所述，CCK-8檢測法是一種靈敏可靠、簡便快捷的方法。本研究中建立的最佳實驗條件可為生物醫(yī)學(xué)許多領(lǐng)域，如對具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物、保健品、中草藥及生物制品的體外篩選和免疫藥理學(xué)作用的研究提供可靠的實驗體系。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sylvester PW. Optimization of the Tetrazolium Dye（MTT） Colorimetric Assay for Cellular Growth and Viability [M]// Drug Design and Discovery. Humana Press，2011：157-168.

[2] Tian Z，An N，Zhou B，et al. Cytotoxic diarylheptanoid induces cell cycle arrest and apoptosis via increasing ATF3 and stabilizing p53 in SH-SY5Y cells [J]. Cancer Chemother Pharmacol，2009，63（6）：1131-1139.

[3] Cory AH，Owen TC，Barltrop JA，et al. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture [J]. Cancer Commun，1991，3（7）：207-212.

[4] Berridge MV，Tan AS，McCoy KD，et al. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use terazolium salts [J]. Biochemica，1996，4：14-19.

[5] Zhang LW，B？覿umer W，Monteiroriviere NA. Cellular uptake mechanisms and toxicity of quantum dots in dendritic cells [J]. Nanomedicine，2011，6（5）：777-791.

[6] Jiang F，Liu T，He Y，et al. MiR-125b promotes proliferation and migration of type Ⅱ endometrial carcinoma cells through targeting TP53INP1 tumor suppressor in vitro and in vivo [J]. BMC Cancer，2011，11（1）：425.

[7] Kan W，Hu X，Du C，et al. Angiotensin-（1-7） suppresses the number and function of the circulating fibrocytes by upregulating endothelial nitric oxide synthase expression [J]. Mol Cell Biochem，2012，365（1-2）：19-27.

[8] Miyamoto T，Min W，Lillehoj HS. Lymphocyte Proliferation Response during Eimeria tenella Infection Assessed by a New，Reliable，Nonradioactive Colorimetric Assay [J]. Avian Diseases，2002，46（1）：10-16.

[9] 梁宏偉，朱雯宇，馮波，等.MTT法檢測大鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)探討與應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2016，32（26）：21-26.

[10] 郭曉瑨，吳文慧，劉靜亞，等.MTT法檢測鈦酸鋇涂層對小鼠成纖維細(xì)胞L929增值率的影響[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（5）：615-619.

[11] 項峰，任利萍，劉克勤，等.子宮頸癌腫瘤干細(xì)胞篩選及體外敏感藥物試驗的臨床對比研究[J].河北醫(yī)藥，2014，36（2）：285-287.

[12] 劉璽章，王代友，陳婷.口腔鱗狀細(xì)胞癌體外藥敏試驗的臨床研究[J].現(xiàn)代診斷與治療，2016，27（2）：239-240.

[13] Goodwin CJ，Holt SJ，Downes S，et al. Microculture tetrazolium assays：a comparison between two new tetrazolium salts，XTT and MTS [J]. J Immunol Methods，1995，179（1）：95-103.

[14] 張會鮮，何琪楊.CCK-8法檢測藥物影響腫瘤細(xì)胞增殖的優(yōu)化研究[J].藥學(xué)研究，2016，35（2）：63-66.

[15] 趙艷坤，邵偉，雒誠龍，等.無血清共培養(yǎng)條件下臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用[J].中國實驗動物學(xué)報，2017，25（4）：391-398.

[16] 蔡文濤.MTT法和CCK-8法檢測中藥抗病毒活性成分細(xì)胞毒性的比較[J].湖北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2017， 39（3）：305-310.

[17] 鄧媛，陶善東，張欣，等.依魯替尼與達(dá)沙替尼對急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的抑制及其機制實驗研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2017，25（1）：72-79.

[18] 彭洪薇，張曉潔，李菲.黃芪多糖聯(lián)合多柔比星抗白血病細(xì)胞HL-60/A耐藥的機制研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2017，25（3）：743-748.

[19] Jiao G，He X，Li X，et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity [J]. Rsc Advances，2015，5（66）：53 240-53 244.

[20] Meyer JS，Koehm SL，Hughes JM，et al. Bromodeoxyuridine labeling for S-phase measurement in breast carcinoma [J]. Cancer，2015，71（11）：3531-3540.

[21] Lin P，Allison DC. Measurement of DNA content and of tritiated thymidine and bromodeoxyuridine incorporation by the same cells [J]. J Histochem Cytochem，1993，41（9）：1435.

（收稿日期：2018-05-07 本文編輯：任 念）