華蟾毒配基抑制組蛋白乙酰化誘導肝癌細胞死亡的機制

畢成 徐瑞成 鄒爽 王聰聰 張妍 徐忠偉

[摘要] 目的 探討華蟾毒配基通過改變表觀遺傳修飾調(diào)控肝癌細胞死亡的機制。 方法 通過CCK-8法檢測不同濃度（0、0.75、1.5、2.5、5、10 μmol/L）華蟾毒配基作用于肝癌HepG2細胞24 h細胞增殖能力的變化；5 μmol/L華蟾毒配基作用HepG2細胞12、24 h后，流式細胞術檢測細胞周期，蛋白印跡檢測鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2β（CaMK2B）、甲基化CpG結合蛋白2（MeCP2）、磷酸化MeCP2（p-MeCP2）、乙?；M蛋白H3.1（Ac-Histone3.1）和甲基化組蛋白（Met-Histone3.1）的表達變化；5 μmol/L華蟾毒配基作用HepG2細胞24 h后，細胞免疫熒光結合掃描共聚焦檢測CaMK2B和MeCP2相互作用。 結果 華蟾毒配基能顯著抑制肝癌HepG2細胞生長，抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），藥物作用細胞后，細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。5 μmol/L華蟾毒配基可促進CaMK2B和MeCP2在細胞核內(nèi)結合，Western blot 結果顯示華蟾毒配基作用HepG2細胞后上調(diào)CaMK2B和p-MeCP2表達（P < 0.05），抑制Ac-Histone3.1表達，促進Met-Histone3.1（P < 0.05）。 結論 華蟾毒配基通過激活CaMK2B-MeCP2信號通路抑制組蛋白乙?；?、促進甲基化繼而誘導肝癌細胞死亡。

[關鍵詞] 華蟾毒配基；肝細胞癌；鈣調(diào)蛋白激酶；表觀遺傳

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of cinobufagin in regulating the death of liver cells by regulating epigenetic modification. Methods The CCK-8 assay was used to detect the changes of proliferation ability after different concentrations （0， 0.75， 1.5， 2.5， 5， 10 μmol/L） of cinobufagin acting on the HepG2 cells for 24 h； after 5 μmol/L of cinobufagin acting on the HepG2 cells for 12， 24 h， the cell cycle was detected by flow cytometry， and the expression levels of Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase 2β （CaMK2B）， methylated-cpg binding protein （MeCP2）， phosphorylation-MeCP2 （p-MeCP2）， acetylated histone H3.1 （Ac-Histone3.1） and methylated histones （Met-Histone3.1） were detected by Western blot； after 5 μmol/L of cinobufagin acting on the HepG2 cells for 24 h， the interaction between CaMK2B and MeCP2 in HepG2 cells was detected by cell immunofluorescence combined with confocal scanning. Results Cinobufagin could inhibit the growth of HepG2 cells in a dose-independent manner， the difference was statistically significant （P < 0.05）， after the drug acting on the cells， the cell cycle comes up G2/M phase arrest， the difference was statistically significant （P < 0.05）. 5 μmol/L of cinobufagin could promote the incorporation of CaMK2B and MeCP2 in cell nucleus， the results of Western blot showed that the cinobufagin could increase the expression of CaMK2B and MeCP2 after acting on HepG2 cells （P < 0.05）， inhibit the expression of the Ac-Histone3.1， and promote the Met-Histone3.1 （P < 0.05）. Conclusion Cinobufagin can induce the death of liver cells by activating the CaMK2B-MeCP2 signal path， inhibiting histone acetylation and promoting histone methylation.

[Key words] Cinobufagin； Hepatocellular carcinoma； Calmodulin kinase； Epigenetic

蟾酥的主要成分是華蟾毒配基等，與植物來源的哇巴因和地高辛等均屬于強心苷類固醇物質（cardiotonic steroids，CSs）[1-3]。CSs是鈉鉀ATP酶抑制因子，可以增加細胞內(nèi)Na+濃度，間接促進細胞內(nèi)Na+和細胞外Ca2+的交換，導致細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，增強心肌收縮力[4-5]。值得關注的是，國外20年的流行病學研究發(fā)現(xiàn)，激素敏感型癌癥（宮頸癌和乳腺癌）患者術后服用強心苷類固醇藥物地高辛拮抗化療誘發(fā)的心力衰竭，能夠使患者5年死亡率從34%顯著降低至6%[6]。CSs也能激活Ca2+信號途徑誘導腫瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSGs）重編程發(fā)揮抗癌作用[7]。我們前期研究結果顯示，華蟾毒配基能夠顯著改變肝癌細胞DNA分子的拓撲結構，引起染色體重塑，參與基因轉錄表達的重新編程[8]。然而具體機制尚不明確，因此，我們推測華蟾毒配基可能通過改變肝癌細胞表觀遺傳發(fā)揮抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人肝癌細胞株HepG2：中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

1.1.2 藥物與試劑 華蟾毒配基（C1272，Sigma公司）；胎牛血清（12483020）、高糖培養(yǎng)基（11995073）、胰蛋白酶（25300062）、FITC和TRITC標記的熒光二抗（A10530和T-2769）購自于Thermo-Fisher公司；兔抗人單克隆抗體鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2β（CaMK2B）（ab71709）、磷酸化甲基化CpG結合蛋白（p-MecP2）（ab2828）、乙?；M蛋白H3.1（Ac-Histone3.1）（ab 4729）、甲基化組蛋白（Met-Histone）（ab8580）和組蛋白Histone H3.1（ab12079）、小鼠抗人MeCP2抗體（ab 50005）購自于Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（5210-0176）、羊抗小鼠二抗（5230-0364）和ECL顯影液（5430-0042）購自于KPL公司；CCK-8（40203ES60）、DMSO（60313ES60）、DAPI（40728ES03）和細胞周期檢測試劑盒（40301ES50）購自于上海翊圣生物科技有限公司，其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2為貼壁生長細胞，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素抗生素H-DMEM培養(yǎng)基中，細胞融合度達到85%時，常規(guī)0.25%胰酶消化細胞傳代培養(yǎng)，每隔36 h換液。細胞培養(yǎng)環(huán)境條件為5%CO2、37℃和飽和濕度。

1.2.2 CCK-8法檢測華蟾毒配基對HepG2增殖的影響 取對數(shù)生長期HepG2細胞株，常規(guī)消化為單細胞懸液，以每孔5000個/100 μL接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同濃度華蟾毒配基（0、0.75、1.25、2.5、5、10 μmol/L），繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標儀在激發(fā)波長450 nm處檢測吸光度值，計算細胞生長抑制率：存活率（%）=（A實驗-A空白）/（A對照-A空白）×100%。計算華蟾毒配基半數(shù)有效抑制濃度IC50值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 實驗分組：5 μmol/L華蟾毒配基作用0、12、24 h。常規(guī)收集細胞，0.25%胰酶消化細胞收集到離心管，1000 g離心10 min，棄上清，加入預冷PBS再次離心，棄上清，用75%冷乙醇固定，上機前離心棄上清，PBS洗1次，過300目篩網(wǎng)，加入100 μg/mL RNase，40 μg/mL碘化丙啶（PI），0.2% Triton X-100避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。用Flowjo軟件對流式結果進行分析處理。

1.2.4 細胞免疫熒光華蟾毒配基對CaMK2B和MeCP2相互作用的影響 取對數(shù)生長期HepG2細胞株，常規(guī)消化為單細胞懸液，以1×104個/mL接種于共聚焦平皿中24 h后，加入5 μmol/L華蟾毒配基作用12、24 h后，PBS小心去除血清，清洗細胞，用70%甲醇溶液4℃固定細胞30 min，0.5% Triton X-100孵育15 min破細胞膜，5%山羊血清封閉1 h，分別標記兔抗人單克隆抗體CaMK2B（1∶200稀釋），小鼠抗人MeCP2抗體（1∶150稀釋）4℃孵育過夜，PBST清洗3次，每次10 min，分別標記抗兔FITC標記熒光二抗和抗小鼠TRITC標記熒光二抗（1∶200稀釋）。PBST清洗3次，每次10 min。用10 μg/mL DAPI復染細胞核。萊卡掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光，F(xiàn)ITC激發(fā)波長488 nm，TRITC激發(fā)波長552 nm，DAPI激發(fā)波長405 nm。熒光強度分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.2.5 Western blot檢測細胞表觀遺傳相關蛋白的表達 將對照組細胞和華蟾毒配基加藥處理12、24 h后細胞，0.25%胰酶消化細胞，1200 g離心10 min收集細胞，棄上清。每25平方厘米細胞培養(yǎng)瓶細胞加入RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制劑），非接觸式超聲4℃破碎細胞，工作5 s，間歇5 s，共30個循環(huán)，14 000 g離心10 min，收集上清液。BCA定量法檢測蛋白濃度，以60 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干轉膜法轉移至0.22 μm硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過夜，PBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶10 000稀釋的二抗常溫孵育1 h，PBST溶液洗膜3次，每次10 min，ECL液化學發(fā)光，暗室曝光顯影，用Scion Image軟件進行灰度值分析，β-actin作為胞漿蛋白校正內(nèi)參，Histone H3.1作為核蛋白校正內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 華蟾毒配基對HepG2細胞增殖活性的影響

CCK-8結果顯示，不同濃度（0.75、1.25、2.5、5、10 μmol/L）華蟾毒配基作用HepG2細胞24 h后，細胞生長抑制率分別為（75.9±8.2）%、（71.9±7.5）%、（61.9±6.8）%、（51.7±4.1）%和（39.7±8.2）%。華蟾毒配基對肝癌HepG2細胞生長有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性（F = 6.37，P < 0.05）。華蟾毒配基作用HepG2細胞24 h的IC50值為5.1 μmol/L。見圖1。

2.2 華蟾毒配基對HepG2細胞周期的影響

細胞周期結果顯示，對照組處于G2/M期細胞的比例為（16.17±2.77）%，5 μmol/L華蟾毒配基作用12 h后處于G2/M期細胞的比例為（31.14±5.48）%，作用24 h處于G2/M期細胞的比例為（49.14±6.48）%。細胞周期結果顯示，華蟾毒配基能夠引發(fā)HepG2細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，且呈現(xiàn)作用時間依賴性（F = 8.32，P < 0.05）。見圖2。

2.3 華蟾毒配基對CaMK2B和MeCP2相互作用的影響

細胞免疫熒光結果顯示，對照組細胞綠色熒光CaMK2B和紅色熒光MeCP2在細胞核和細胞胞漿中均有顯著的共定位關系，呈現(xiàn)明亮且均勻分布的共定位關系，當華蟾毒配基作用HepG2細胞24 h后，紅色與綠色熒光集中于細胞核邊緣，且熒光密度與對照組比較顯著增加（t = 7.03，P < 0.05），結果提示華蟾毒配基能促進CaMK2B和MeCP2在細胞核內(nèi)發(fā)生相互作用。見圖3（封三）。

2.4 華蟾毒配基對肝癌細胞HepG2中CaMK2B和MeCP2表達的影響

Western blot結果顯示，經(jīng)過華蟾毒配基作用12、24 h后，CaMK2B和p-MeCP2水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（F = 8.32，P < 0.05），且呈現(xiàn)作用時間依賴性（F = 5.37，P < 0.05），而MeCP2表達無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖4。

2.5 華蟾毒配基對肝癌細胞HepG2表觀遺傳作用相關分子表達的影響

Western blot結果顯示，經(jīng)過華蟾毒配基作用12、24 h后，組蛋白乙?；斤@著降低，差異有統(tǒng)計學意義（F = 6.32，P < 0.05）；組蛋白甲基化水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（F = 9.41，P < 0.05）。見圖5。

3 討論

肝細胞癌是全球第三大惡性腫瘤，也是人類腫瘤相關死亡的第二大原因[9]。肝癌發(fā)現(xiàn)即晚期，失去手術治療機會，因此，選擇有效治療肝癌的靶基因和治療藥物具有重要的意義。

華蟾毒配基作為從中藥蟾酥中提取的活性成分，是一種強心苷類固醇類物質，作為鈉鉀泵的天然抑制劑，具有良好的抗腫瘤活性，且毒性低，副作用小。研究顯示，人肝癌組織中鈉鉀ATP酶呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。腫瘤組織與正常組織中NKA表達狀態(tài)的差異化，為以華蟾毒配基為代表的蟾酥活性成分提供了潛在的藥物作用靶點[10]。前期研究顯示，華蟾毒配基可引起肝癌細胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著升高，誘導細胞凋亡，因此我們推測華蟾毒配基可激活肝癌細胞鈣信號介導細胞死亡[11]，當前研究發(fā)現(xiàn)華蟾毒配基作用肝癌HepG2細胞后能顯著增加CaMK2B表達水平。CaMK2B是CaMK家族的重要一員，屬于多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長、增殖速度、細胞周期、凋亡率和細胞侵襲性等生物學行為中發(fā)揮著重要作用[12]；同時CaMK2B也參與腫瘤細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)以及與組蛋白去乙?；?（HDAC9）結合催化組蛋白的去乙?；M程，參與癌/抑癌相關基因轉錄表達過程[13-16]。而MeCP2蛋白是甲基化結合蛋白家族中的主要成員，與組蛋白去乙?；笍秃衔镏苯酉嗷プ饔?，同時利用其對甲基化DNA的特異性識別，間接促進染色體組蛋白的去乙?；?，易化DNA的甲基化封閉過程，抑制下游抑癌基因的轉錄[17-20]。當前研究提示，華蟾毒配基能促進肝癌細胞CaMK2B和MeCP2之間的相互作用，且上調(diào)CaMK2B和p-MeCP2表達，此時與染色體結合的MeCP2減少，抑制染色體組蛋白乙酰化，促進組蛋白甲基化。

綜上所述，華蟾毒配基可能通過激活CaMK2B-MeCP2信號通路抑制細胞組蛋白乙?；T導肝癌細胞死亡。

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（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：張瑜杰）