雌、孕激素對人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A的表達調(diào)節(jié)

楊一凡，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

跨膜蛋白16A(TMEM16)屬于“未知功能的跨膜蛋白16”一族，因其家族為陰離子通道(anion)并預(yù)測有8個跨膜區(qū)片段(octa)，故其又稱為anoctamin 1(ANO1)。TMEM16A的基因定位于人類染色11q13區(qū)域，此區(qū)域的很多基因在上皮類癌癥如乳腺癌、肺癌和口腔上皮癌中高表達，因此在被確認為鈣激活氯離子通道(CaCCs)的分子基礎(chǔ)之前，TMEM16A主要在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等相關(guān)研究中被大家熟知[1-2]。2008年CELL、SCIENCE和NATURE三個頂級期刊同時確定了TMEM16A為CaCCs的分子基礎(chǔ)，自此其作為CaCCs分子基礎(chǔ)的相關(guān)研究得以展開[3-5]?，F(xiàn)已知TMEM16A在唾液腺、氣管、血管平滑肌、胃腸道等多種器官和組織中廣泛表達，并在多種生理反應(yīng)過程中起著重要的作用[6-9]。在生殖道中，TMEM16A被發(fā)現(xiàn)在小鼠利用特異性氯通道抑制劑能明顯減弱小鼠子宮平滑肌的自發(fā)性收縮；在小鼠卵巢顆粒細胞的質(zhì)膜上同樣發(fā)現(xiàn)了TMEM16A的存在，通過激活MEK/ERK途徑從而下調(diào)芳香化酶的表達進而抑制雌激素的合成[10]；TMEM16A還可能參與了輸卵管對精子、卵母細胞和受精卵的運輸過程[11]。雖然TMEM16A在以上生殖道組織和器官中被證實表達并發(fā)揮一定的生理功能，但在正常人子宮內(nèi)膜上的表達及其相關(guān)功能研究卻鮮有報道。目前僅有我們前期的研究結(jié)果顯示TMEM16A在人正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜增殖期和分泌期呈差異性表達[12]，提示其可能受雌、孕激素的調(diào)節(jié)，參與子宮內(nèi)膜容受性的建立。本研究擬通過體外實驗探討雌、孕激素在子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中對TMEM16A的表達調(diào)節(jié)。

材料和方法

一、主要材料和試劑

人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊增明教授饋贈。無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)、胎牛血清(Gibco，美國)、Q-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Bio，日本)、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara Bio，日本)、兔抗人多克隆TMEM16A一抗(Abcam ab72984，英國)和山羊抗兔二抗(ASPEN AS1107，武漢)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物，上海)、5×蛋白上緩沖液(賽維爾生物，武漢)、內(nèi)參β-actin(賽維爾生物，武漢)、雌二醇(E2，Sigma，美國)、孕酮(P4，Sigma，美國)。

二、實驗方法

1.子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系培養(yǎng)和分組：子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系為貼壁細胞，細胞復(fù)蘇后置于10%胎牛血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代，將細胞按2×106個/孔的密度均勻種在6孔板上，培養(yǎng)24 h，用含0.5%炭吸附胎牛血清的無酚紅RPMI-1640饑餓處理，24 h后根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒灧椒▽毎M行分組和相應(yīng)處理。

2.免疫熒光(Immunofluorescence)檢測TMEM16A在子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的定位：將細胞按2×105個/cm2的密度種在有無菌蓋玻片的6孔板中，置于10%胎牛血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)。待細胞融合度達到40%～50%后，用預(yù)溫的PBS洗滌蓋玻片3次，每次5 min。用4%多聚甲醛室溫固定30 min，其后，小心取出蓋玻片，放入封閉液，37℃，60 min。輕輕甩掉封閉液，在玻片上滴加用PBS配好的兔抗人多克隆抗體TMEM16A一抗(1∶200)，玻片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。玻片置于PBS中在搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。玻片稍微甩干后加入山羊抗兔二抗(1∶200)，避光室溫孵育60 min。將玻片置于PBS中在搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，稍甩干后滴加DAPI染色，避光室溫孵育10 min。熒光封片液封片后置于倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

3.實時熒光定量(Q-PCR)檢測各組TMEM16A mRNA在人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達：細胞饑餓處理24 h后，將細胞分為E2組、P4組、E2+P4組和空白對照組。E2組加入10-8mol/L E2；P4組加入10-6mol/L P4；E2+P4組加入10-8mol/L E2和10-6mol/L P4；空白對照組加入0.1%二甲基亞砜(DMSO)。各組分別培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，按Trizol試劑說明提取各組細胞的總RNAs，測定各組總RNAs濃度和OD值，若OD值在1.8～2.2之間，取1 μg各組總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄說明書，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA，總體系為10 μl。隨后對總RNAs進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行Q-PCR檢測，實驗獨立重復(fù)3次。Q-PCR所用引物見表1。

表1 Q-PCR所用引物

4.Western blotting檢測各組TMEM16A蛋白質(zhì)在人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達：細胞饑餓處理24 h后，將細胞分為E2組、P4組、E2+P4組和空白對照組。E2組加入10-8mol/L E2；P4組加入10-6mol/L P4；E2+P4組加入10-8mol/L E2和10-6mol/L P4；空白對照組加入0.1% DMSO。各組分別培養(yǎng)48 h，用TBS緩沖液潤洗貼壁細胞2～3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入80 μl的細胞總蛋白提取試劑于6孔板內(nèi)裂解3～5 min。用細胞刮刀將細胞刮下，收集到1.5 ml離心管中。冰浴30 min，4℃13 000g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上緩沖液后煮沸8 min使蛋白變性，使用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，然后將凝膠上分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加兔抗人TMEM16A多克隆抗體一抗(1∶1 000)，內(nèi)參β-actin(1∶1 000)，均4℃孵育過夜。PBS漂洗3遍后，二抗室溫孵育1 h(1∶5 000)，再次用PBS漂洗3遍，使用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜并分析條帶。實驗獨立重復(fù)3次。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件，計量資料多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組計量資料比較采用非配對t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TMEM16A蛋白質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的定位

免疫熒光結(jié)果顯示Ishikawa細胞的細胞核被DAPI染成藍色(圖1A)；TMEM16A蛋白質(zhì)在Ishikawa細胞的細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核上均有表達，且主要集中在細胞膜上(圖1B)。

A：DAPI染色的細胞核(×200)；B：TMEM16A染色(×200)；C：細胞核和TMEM16A合并(×200)圖1 TMEM16A蛋白質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的熒光染色結(jié)果

二、E2、P4對人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA表達的影響

Q-PCR結(jié)果顯示了E2和P4對人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA表達的影響(圖2)。與空白對照組相比，不論是E2組、P4組或E2+P4組均可顯著提高Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA的表達水平(P<0.01)。其中，E2+P4組TMEM16A mRNA的表達水平較E2組和P4組顯著升高(P<0.01)；P4組TMEM16A mRNA的水平較E2組顯著升高(P<0.01)。

圖2 各組TMEM16A mRNA在子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達水平，**P<0.01

三、E2、P4對人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A 蛋白質(zhì)表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示了E2和P4對人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A 蛋白質(zhì)表達的影響(圖3)。與空白對照組相比，E2組、P4組或E2+P4組均可顯著提高Ishikawa細胞中TMEM16A蛋白的表達水平(P均<0.05)。其中，E2+P4組TMEM16A 蛋白的表達水平較E2組和P4組均顯著升高(P均<0.05)。P4組TMEM16A 蛋白水平較E2組高(P<0.05)。

圖3 各組TMEM16A 蛋白質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達及水平比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

Ishikawa細胞系是高分化的人子宮內(nèi)膜腺癌細胞，因其具有E2、P4受體以及正常子宮內(nèi)膜上皮細胞的相關(guān)特性而被用于子宮內(nèi)膜上皮細胞功能的相關(guān)研究[13-14]。TMEM16A現(xiàn)已被證實存在于多種組織和器官中，但在子宮內(nèi)膜中的表達和相關(guān)功能尚不明確。目前，僅有我們前期的研究結(jié)果顯示TMEM16A在人正常月經(jīng)周期不同時期的子宮內(nèi)膜中存在表達差異，并可能受E2、P4的調(diào)節(jié)。

為了進一步確定TMEM16A在子宮內(nèi)膜細胞中的表達以及受E2、P4的調(diào)節(jié)作用，我們在體外培養(yǎng)的Ishikawa細胞系中，首先利用免疫熒光確定了TMEM16A在Ishikawa細胞系上存在表達，且主要定位于細胞膜上。

子宮內(nèi)膜受卵巢甾體激素E2和P4的影響而發(fā)生周期性的變化。在E2、P4的作用下，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、粘附分子、各種細胞因子和生長因子等在內(nèi)的許多分子在不同時期的子宮內(nèi)膜中呈時空特異性表達。E2、P4對細胞功能的調(diào)節(jié)主要通過以下兩條途徑，即經(jīng)典的基因組學(xué)途徑和非基因組學(xué)途徑?；蚪M學(xué)途徑又稱慢作用途徑，E2、P4通過與胞內(nèi)的受體結(jié)合后進入細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合后，上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因的表達；非基因組學(xué)途徑下，雌、孕激素可與細胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Ca2+作為第二信使，完成信號傳遞，使E2、P4在短期內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)[15]。另有研究證明，E2、P4還可以通過非基因組學(xué)效應(yīng)激活細胞內(nèi)Ca2+的釋放[16-17]。當(dāng)胞漿內(nèi)的Ca2+達到一定的濃度時，TMEM16A作為CaCCs的分子基礎(chǔ)，與Ca2+結(jié)合激活CaCCs，從而氯離子通道開放。但TMEM16A與Ca2+的相關(guān)結(jié)合位點及激活的相關(guān)機制仍不明確?；谝陨系难芯堪l(fā)現(xiàn)，我們推測當(dāng)E2、P4與子宮內(nèi)膜細胞上的相應(yīng)受體相結(jié)合時，可以激活胞漿內(nèi)Ca2+的釋放，Ca2+又作為第二信使參與E2、P4對細胞的調(diào)節(jié)。

為了確定E2和P4對Ishikawa細胞系中TMEM16A的表達具有調(diào)節(jié)作用，我們在體外培養(yǎng)Ishikawa細胞系中分別用E2、P4和E2+P4進行干預(yù)處理48 h，其后，通過Q-PCR技術(shù)和Western blotting技術(shù)檢測Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA和蛋白的表達情況。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不論是E2、P4單獨處理或E2+P4聯(lián)合處理均可顯著提高Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA的表達(P均<0.05)。E2+P4組TMEM16A的表達最高，與E2或P4單獨處理相比有顯著性差異(P均<0.01)，并且P4組TMEM16A的表達高于E2組(P<0.01)。Western boltting結(jié)果顯示TMEM16A蛋白質(zhì)的變化趨勢與mRNA的變化趨勢基本一致。以上結(jié)果說明在Ishikawa細胞系中TMEM16A的表達水平受到E2和P4的調(diào)節(jié)，兩種激素同時作用時表達水平最高，提示P4的調(diào)節(jié)作用有可能大于E2，但仍需進一步研究確定。

當(dāng)子宮內(nèi)膜處于分泌中、晚期時(月經(jīng)第20～24天)，E2和P4的分泌達到高峰，此時子宮內(nèi)膜容受性最高，只在這個特定的時期，活化的胚胎才能在子宮內(nèi)膜上進行定位、粘附和侵入，順利完成著床，這個特定的時期成為“窗口期”?！按翱谄凇痹贓2和P4的協(xié)同調(diào)控下，生長因子、粘附分子等諸多因子被激活并相互對話，包括白血病抑制因子(LIF)和整合素av β3等子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志性分子在此階段呈高表達狀態(tài)。

綜上，本研究結(jié)果提示TMEM16A可能作為胚胎著床的關(guān)鍵信號分子之一參與子宮內(nèi)膜容受性的建立，也有可能是雌、孕激素通過非基因組學(xué)途徑刺激胞內(nèi)Ca2+的釋放，導(dǎo)致TMEM16A的激活，這仍需進一步研究。