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    三七總皂甙對(duì)高脂飲食糖尿病大鼠炎癥因子和主動(dòng)脈脂質(zhì)代謝的影響

    2018-09-10 11:47:54鄭建雷李忠杰孫渴望王海清
    浙江醫(yī)學(xué) 2018年15期
    關(guān)鍵詞:汀組高脂主動(dòng)脈

    鄭建雷 李忠杰 孫渴望 王海清

    冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是多因素作用的慢性炎癥過程,其中高脂血癥和糖尿病是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)三七總皂甙(panax notoginseng saponins,PNS)具有改善血脂代謝、減輕和延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)展的作用[2]。本研究進(jìn)一步探討PNS對(duì)糖尿病和高脂飲食狀態(tài)下SD大鼠炎癥因子水平以及主動(dòng)脈脂質(zhì)代謝基因的影響,為PNS用于治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 動(dòng)物 雄性2月齡SD大鼠46只,體重200~250g,由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供,普通飼料飼養(yǎng)2周后,其中36只用于制造糖尿病模型。

    1.2 材料和儀器 PNS(批號(hào)160902,純度88.2%,云南昆藥集團(tuán));阿托伐他汀鈣片(Phizer公司,美國(guó));鏈脲佐霉素(STZ,Sigma公司,美國(guó));空腹血糖、血脂水平測(cè)定(Roche Diagnostics公司,德國(guó));大鼠TNF-α試劑盒(北京博凌科為公司);大鼠IL-13試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司),大鼠IL-1β試劑盒(上海依科賽生物科技有限公司),血糖儀(強(qiáng)生公司,美國(guó))。 PCR引物(北京擎科生物有限公司);TRIzol(Gibco BRI公司,美國(guó));RT-PCR 試劑盒(Genecopoeia公司,美國(guó));SYBR Green PCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技);PCR擴(kuò)增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)),兔抗TLR-4(Proteintech,美國(guó));兔抗 SB-RI(Proteintech,美國(guó));鼠抗ABCA1(Abcam,英國(guó));小鼠單抗 β-actin、HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);ECL底物液(Thermo,美國(guó))。

    1.3 糖尿病大鼠建模、分組和干預(yù) 造模過程如下:大鼠禁食、禁水4h后,腹腔注射STZ溶液 [將STZ溶于0.1mol/L的檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)中,終濃度為6.5mg/ml];每只大鼠按65mg/kg劑量腹腔注射,注射后繼續(xù)禁水4h,隔日尾靜脈采血,測(cè)血糖在15mmol/L以上為造模成功[3],共成功30只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為高脂飲食合并糖尿病組(糖尿病組)、高脂飲食合并糖尿病PNS治療組(PNS組)、高脂飲食合并糖尿病他汀治療組(他汀組),每組10只,另10只未建模大鼠設(shè)為單純高脂飲食非糖尿病組(對(duì)照組)。4組大鼠均予高脂飲食喂養(yǎng)12周。高脂飲食成分:膽固醇3.0%,膽鹽0.5%,甲基硫氧嘧啶0.2%,蔗糖5%,豬油10%,基礎(chǔ)料81.3%。第5周起,他汀組和PNS組在每天上午分別給予阿托伐他汀鈣片(美國(guó)輝瑞公司)20mg/kg體重灌胃,PNS 80mg/kg體重灌胃,對(duì)照組和糖尿病組予等量0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)8周,飼養(yǎng)期間飲水和飼料量不限。

    1.4 大鼠體重、血糖血脂水平和血清炎癥因子水平測(cè)定 記錄試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠的體重。各組大鼠給予高脂飼養(yǎng)飲食或聯(lián)合藥物干預(yù)12周后處死。處死前禁食12h,不禁水,戊巴比妥鈉腹腔麻醉后,經(jīng)心臟采血,血液經(jīng)3 000r/min離心所得血清儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。分離的主動(dòng)脈組織一部分用于冷凍切片,另一部分保存在-80℃冰箱,用于后續(xù)PCR和Western blot檢測(cè)??崭寡?、TC、LDL-C和TG水平的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)法使用Hitachi 912分析儀(Roche diagnostics公司,德國(guó))。血清炎性因子TNF-α,IL-13,IL-1β水平測(cè)定根據(jù)Elisa試劑盒的說明進(jìn)行。

    1.5 主動(dòng)脈油紅染色 用干凈清潔的硅化載玻片粘取冷凍切片,等到切片干燥后加入60%異丙醇浸洗10min,油紅O工作液染色10min,60%異丙醇分化3~10s后水洗,Mayer蘇木精復(fù)染1min,自來(lái)水返藍(lán),用濾紙吸干水分,甘油明膠封片。

    1.6 qRT-PCR法檢測(cè)主動(dòng)脈組織TLR4、SR-BI、ABCA1 mRNA表達(dá) 在Pubmed上尋找基因序列:借助Premier 5.0設(shè)計(jì)引物序列(見表1)。按 Trizol Reagent(Gibco BRL,美國(guó))試劑盒說明書提取大鼠主動(dòng)脈血管總 RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD260/OD280,計(jì)算RNA純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Genecopoeia公司生產(chǎn))說明操作,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件:50℃,2min,95℃,10min;95℃,30s,60℃,30s,共40cycles,最后行融合曲線分析。PCR產(chǎn)物5μl,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,通過Gen Genius全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各條帶的光密度。熒光實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù):熒光實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析[采用相對(duì)性Ct(ΔΔCt)]作為定量方法進(jìn)行比較,以β-actin為管家基因,校正每個(gè)樣品的Ct值。

    1.7 Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈TLR-4、ABCA1和SR-BI蛋白表達(dá) 在每1ml冷Lysis Buffer溶液中加入5μl磷酸酶抑制劑,1μl蛋白酶抑制劑和5μl 100mM PMSF混勻,冰上保存數(shù)分鐘待用。每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中,手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊,加入0.5~1ml冷Lysis Buffer,玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次,注意低溫操作;取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml預(yù)冷的離心管,4℃下12 000r/min離心5min;取上清液轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷離心管中,即為組織全蛋白提取物,分裝保存于-70℃?zhèn)溆?,避免反?fù)凍融。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白加熱變性,制作電泳膠,取總蛋白40μg經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2h。TBST洗膜后分別加入β-actin(1∶200),TLR-4(1∶1 000)、SR-BI(1 ∶500)和 ABCA1(1 ∶300)一抗,4℃孵育過夜。TBST洗膜10min 3次,再分別加入相應(yīng)的二抗,室溫下振蕩孵育2h。把膜移入暗室,加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑,根據(jù)條帶強(qiáng)弱,調(diào)整曝光時(shí)間。利用凝膠成像分析軟件Bandscan進(jìn)行分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以 表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 干預(yù)后各組大鼠血脂、血清炎癥因子、空腹血糖和體重比較 見表2。

    由表2可見,干預(yù)前各組體重?zé)o明顯差異,而干預(yù)后,糖尿病組、PNS組和他汀組體重比對(duì)照組明顯降低(均P<0.01)。糖尿病組、PNS組和他汀組空腹血糖較對(duì)

    表2 干預(yù)后各組大鼠血脂、血清炎癥因子、空腹血糖和體重比較

    照組明顯升高(均P<0.01)。與糖尿病組比較,PNS組和他汀組血清 TG、TC、TNF-α、IL-1β 和 LDL-C 水平均降低(均P<0.05),與PNS組比較,他汀組LDL-C降低更為明顯(P<0.01)。糖尿病組血清IL-13水平較對(duì)照組降低(P<0.05),經(jīng)PNS和他汀干預(yù)后IL-13表達(dá)均有所升高,但與糖尿病組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2.2 各組大鼠主動(dòng)脈冷凍切片油紅染色結(jié)果 見圖1。

    圖1 各組大鼠主動(dòng)脈冷凍切片油紅染色圖

    由圖1可見,糖尿病組血管內(nèi)膜及外膜脂質(zhì)含量明顯增加;PNS組和他汀組主動(dòng)脈內(nèi)膜及外膜的脂質(zhì)含量均明顯改善,他汀組主動(dòng)脈脂質(zhì)含量降低更為明顯;對(duì)照組脂滴在主動(dòng)脈血管上的表達(dá)最少。

    2.3 各組大鼠主動(dòng)脈TLR-4、SR-BI和 ABCA1 mRNA表達(dá)量比較 見圖2。

    由圖2可見,糖尿病組大鼠主動(dòng)脈組織的TLR-4 mRNA表達(dá)明顯較對(duì)照組升高(P<0.01)。與糖尿病組比較,他汀組TLR-4 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01),SB-RImRNA和ABCA1mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.01);與糖尿病組比較,PNS組TLR-4 mRNA表達(dá)降低,SBRI mRNA和ABCA1 mRNA水平升高,但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

    圖2 各組大鼠主動(dòng)脈TLR-4、SR-BI和ABCA1 mRNA表達(dá)量比較(與糖尿病組比較,**P<0.01)

    2.4 各組大鼠主動(dòng)脈TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表達(dá)比較 見圖3。

    圖3 各組大鼠主動(dòng)脈TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表達(dá)比較(與糖尿病組比較,**P<0.01;與他汀組比較,▲P<0.05)

    由圖3可見,與對(duì)照組比較,糖尿病組主動(dòng)脈組織TLR-4蛋白明顯升高(P<0.01),SB-RI蛋白和ABCA1蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.01)。與糖尿病組比較,PNS組和他汀組TLR-4蛋白表達(dá)均明顯降低(均P<0.01),SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表達(dá)均明顯升高(均P<0.01)。而PNS組SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表達(dá)水平均低于他汀組(均P<0.05)。

    3 討論

    動(dòng)脈粥樣硬化是血脂代謝異常、高血糖和高血壓等多因素作用下的慢性炎癥性疾病,它的發(fā)生、發(fā)展過程與血管局部及全身的炎癥反應(yīng)可能存在密切的關(guān)系,而血管內(nèi)皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化病變的始動(dòng)因子[1,4]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病組高脂喂養(yǎng)的SD大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜和外膜脂質(zhì)含量增加,血清炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)增加,而抗炎因子IL-13表達(dá)降低,血管壁TLR-4基因和蛋白表達(dá)明顯升高,而逆膽固醇脂轉(zhuǎn)運(yùn)的SR-BI和ABCA1在血管壁上表達(dá)降低。PNS和阿托伐他汀鈣干預(yù)后血清炎癥因子表達(dá)降低,主動(dòng)脈血管壁SR-BI和ABCA1基因及蛋白表達(dá)上調(diào)。

    炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)過程,高脂、高血糖狀態(tài)下,炎癥反應(yīng)更加劇烈[2,5]。本研究也觀察到類似的結(jié)果,糖尿病組SD大鼠的血清炎癥因子表達(dá)較對(duì)照組SD大鼠明顯升高。這與他汀具有調(diào)脂作用外,尚有抗炎的作用相關(guān)[6]。動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下往往TNF-α和IL-1β等促炎癥因子表達(dá)增加,而抗炎因子如IL-13表達(dá)減少[7-8]。本研究中糖尿病組SD大鼠經(jīng)他汀治療后,除降低LDL外,明顯降低血清炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá),同時(shí)增加抗炎因子IL-13表達(dá)。既往的研究發(fā)現(xiàn)PNS具有抗炎、抗氧化的作用,改善不穩(wěn)定心絞痛患者的血清炎癥因子表達(dá),改善冠心病心絞痛的臨床癥狀[9-10]。我們發(fā)現(xiàn)PNS具有類似于阿托伐他汀鈣降低TNF-α和IL-1β,以及升高IL-13水平的作用。然而,糖尿病組SD大鼠的體重明顯低于對(duì)照組,可能與STZ所致的糖尿病類似于臨床上的1型糖尿病,消瘦表現(xiàn)更為明顯,而與腹型肥胖為特征的2型糖尿病不同。他汀與PNS均不能有效改善STZ所致糖尿病大鼠的血糖和體重,這可能與PNS對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)作用不是通過調(diào)節(jié)血糖實(shí)現(xiàn)有關(guān)。

    動(dòng)脈粥樣斑塊中TLR-4表達(dá)明顯增加,促進(jìn)清道夫受體CD36表達(dá)增強(qiáng),促使巨噬細(xì)胞攝入oxLDL,加速泡沫細(xì)胞的破裂和斑塊的不穩(wěn)定[11]。SR-BI是第一個(gè)在分子水平確定的HDL的天然膜受體,促進(jìn)膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[12];而ABCA1表達(dá)增加促進(jìn)游離膽固醇結(jié)合到乏酯的新生HDL上,起著膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)作用,也具有改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用[13]。大量的研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥和糖尿病明顯降低ABCA1和SR-BI的基因表達(dá),升高TLR-4的基因表達(dá),而他汀類藥物有降低TLR-4表達(dá)與升高SR-BI和ABCA1基因表達(dá)作用,本研究與既往的報(bào)道相類似[14-15]。PNS具有調(diào)整血脂代謝的作用[2],但PNS干預(yù)組SD大鼠后,LDL-C降低不如他汀組明顯,這可能與他汀具有更明顯抑制膽固醇合成的作用有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)PNS與他汀具有類似的上調(diào)SR-BI和ABCA1基因表達(dá)和降低TLR-4基因表達(dá),但與糖尿病組SD大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而蛋白水平比較存在差異,可能是PNS加強(qiáng)TLR-4、SR-BI和ABCA1基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)節(jié)有關(guān),但具體機(jī)制有待于后續(xù)的研究。PNS降低主動(dòng)脈脂滴的沉著,可能是通過調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響血脂的代謝和改善粥樣硬化的斑塊進(jìn)展。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)PNS具有降低糖尿病高脂喂養(yǎng)SD大鼠的炎癥因子表達(dá),改善動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥狀態(tài),減緩高脂血癥、高血糖狀態(tài)對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊的進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步闡述PNS在分子水平上對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制提供新的理論依據(jù),也部分解釋了PNS改善心絞痛癥狀和穩(wěn)定斑塊可能是通過改善脂質(zhì)代謝和減輕炎癥的作用有關(guān)。

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