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    HPLC法同時測定溫經(jīng)湯中10種活性成分的含量

    2018-09-10 11:45:44邵長森張國青韓真真徐桂紅林桂濤盛華剛
    中國藥房 2018年19期
    關(guān)鍵詞:溫經(jīng)湯活性成分含量測定

    邵長森 張國青 韓真真 徐桂紅 林桂濤 盛華剛

    中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408(2018)19-2640-04

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.11

    摘 要 目的:建立同時測定溫經(jīng)湯中10種活性成分(芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚和甘草酸銨)含量的方法。方法:采用高效液相色譜(HPLC)法。色譜柱為Kromasil C18,流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,雙波長切換檢測(0~25 min為240 nm,檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸;25~65 min為275 nm,檢測甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨),柱溫為25 ℃,進樣量為20 μL。結(jié)果:芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.04~80.80、19.32~368.40、2.62~52.40、17.52~350.40、2.07~41.40、4.02~80.40、0.56~11.20、1.69~33.80、2.18~43.60、72.10~1 442.00 μg/mL(r均≥ 0.999 6),檢測限分別為0.06、0.03、0.04、0.06、0.07、0.05、0.04、0.06、0.07、0.09 μg/mL,定量限分別為0.17、0.09、0.13、0.19、0.20、0.18、0.11、0.15、0.18、0.25 μg/mL,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性(24 h)試驗的RSD均<3.5%(n=6~7),各種成分的平均加樣回收率為97.72%~100.60%(RSD 為0.80%~2.49%,n=6)。結(jié)論:建立的HPLC法準確可靠、專屬性好,可用于溫經(jīng)湯中芍藥內(nèi)酯苷等10種活性成分含量的同時測定。

    關(guān)鍵詞 溫經(jīng)湯;高效液相色譜法;含量測定;活性成分

    ABSTRACT OBJECTIVE: To establish a method for simultaneous determination of 10 active components (albiflorin, paeoniflorin, β-ecdysterone, liquiritin, ferulic acid, liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, paeonol and ammonium glycyrrhetate) in Wenjing decoction. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid water solution (gradient elution) at the flow rate of 1.0 mL/min, in dual wavelength switching detection (0-25 min, 240 nm for albiflorin, paeoniflorin, β-ecdysterone, liquiritin, ferulic acid; 25-65 min, 275 nm for liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, paeonol, ammonium glycyrrhetate). The column temperature was set at 25 ℃, and sample size was 20 μL. RESULTS: The linear range of albiflorin, paeoniflorin, β-ecdysterone, liquiritin, ferulic acid, liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, paeonol and ammonium glycyrrhetate were 4.04-80.80, 19.32-368.40, 2.62-52.40, 17.52-350.40, 2.07-41.40, 4.02-80.40, 0.56-11.20, 1.69-33.80, 2.18-43.60 and 72.10-1 442.00 μg/mL (all r≥0.999 6), respectively. The limits of detection were 0.06, 0.03, 0.04, 0.06, 0.07, 0.05, 0.04, 0.06, 0.07, 0.09 μg/mL, respectively. The limits of quantitation were 0.17, 0.09, 0.13, 0.19, 0.20, 0.18, 0.11, 0.15, 0.18, 0.25 μg/mL, respectively. RSDs of precision, reproducibility and stability tests (24 h) were all lower than 3.5% (n=6-7). The average recovery rates were 97.72%-100.60% with the RSDs of 0.80%-2.49% (n=6). CONCLUSIONS: The established HPLC method is accurate, reliable and specfic, and suitable for simultaneous determination of 10 active components as albiflorin in Wenjing decoction.

    KEYWORDS Wenjing decoction; HPLC; Content determination; Active component

    溫經(jīng)湯是中醫(yī)“調(diào)經(jīng)止痛”的經(jīng)典名方,出自南宋名醫(yī)陳自明的《婦人大全良方》,現(xiàn)收錄于《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》。該方由當歸、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪術(shù)、人參、甘草、牛膝等9 味中藥組成,具有溫經(jīng)散寒、活血調(diào)經(jīng)的功效,主要用于閉經(jīng)、痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位等證[1-3]。方中,當歸和川芎中的阿魏酸具有明顯的抗氧化、抗炎與抗血小板凝集作用,在心血管疾病的治療中效果顯著[4-5];白芍中的芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷對人體具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用,其中芍藥苷的補血作用目前已有較多報道[6-8];肉桂中的肉桂酸、桂皮醛具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用,在治療不孕不育方面也很有前景[9-10];牡丹皮的有效成分丹皮酚具有解痙、抗過敏、活血化瘀等作用,與芍藥苷聯(lián)合應(yīng)用能顯著改善動物血流動力學(xué)參數(shù)[11-12];甘草中的甘草苷、甘草素、甘草酸銨在機體缺乏雌激素時表現(xiàn)出雌激素樣作用,是甘草治療痛經(jīng)和生殖器官腫瘤的主要活性成分[13];牛膝中的β-蛻皮甾酮屬于昆蟲生長調(diào)節(jié)激素,具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、子宮興奮、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[14-15]。目前,對溫經(jīng)湯的研究多集中在中醫(yī)辨證論治方面,尚未見對溫經(jīng)湯中化學(xué)成分進行定量分析的報道。故本課題組采用高效液相色譜(HPLC)法建立了同時測定以上10種活性成分含量的方法,以期為溫經(jīng)湯的質(zhì)量控制及其后續(xù)的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料

    1.1 儀器

    1260型HPLC儀,包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型二極管陣列檢測器、G1316A型柱溫箱和OpenLAB型色譜工作站(美國Agilent公司);MS105DU型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

    1.2 藥品與試劑

    當歸、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪術(shù)、人參、甘草、牛膝等9味中藥材均購于山東省中醫(yī)院,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定均為真品;芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號分別為:110736- 201741、111638-201706、111610-201607、0773-9910、110786-201604、110710-201720、0708-9704、110731- 201619,純度分別為:95.7%、98.4%、93.1%、98%、98.8%、98%、98.5%、93%);芍藥內(nèi)酯苷對照品(北京索萊寶科技有限公司,批號:713A022,純度:98%)、甘草素對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:Z20J8X- 40262,純度:98%);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Kromasil C18(200 mm× 4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~25 min,14%→22%A;25~65 min,22%→42%A);流速:1.0 mL/min;檢測波長:0~25 min為240 nm(檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷和阿魏酸),25~65 min為275 nm(檢測甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚和甘草酸銨);柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 溫經(jīng)湯標準煎液 根據(jù)《婦人大全良方》中記載的溫經(jīng)湯的制備方法[16],再結(jié)合歷代醫(yī)學(xué)和本草古籍[17-18],最終確定了以下制法:先將方中各單味藥材粉碎為粗粉,然后稱取當歸、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪術(shù)粉末各1.67 g,人參、甘草、牛膝粉末各3.33 g,加水300 mL,混勻,先用武火加熱至沸,然后改用文火慢煎,待煎煮液至160 mL左右(標準煎液制備所需要的時間平均為1 h),趁熱濾過,濾液加水定容至250 mL,即得。

    2.2.2 混合對照品溶液 精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨各對照品適量,分別置于不同量瓶中,加入70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL含上述10種成分依次為808、1 932、655、2 190、1 035、1 005、560、845、1 090、7 210 μg的單一對照品貯備液。精密吸取上述各對照品貯備液適量,置于同一25 mL量瓶中,70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得上述10種成分質(zhì)量濃度依次為80.8、386.4、52.4、350.4、41.4、80.4、11.2、33.8、43.6、1 442 μg/mL的混合對照品溶液。

    2.2.3 供試品溶液 精密吸取溫經(jīng)湯標準煎液15 mL,加70%甲醇定容至50 mL,密閉,稱質(zhì)量,超聲(功率:200 W,頻率:50 kHz)處理10 min,放置過夜,再次稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.3 系統(tǒng)適用性試驗

    吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.25 mL,加70%甲醇稀釋至5 mL;吸取“2.2.3”項下供試品溶液,0.22 μm微孔濾膜過濾。分別將上述3種溶液在“2.1”項色譜條件下進樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果,在該色譜條件下,各待測成分間、待測成分與雜質(zhì)峰間均能達到基線分離,分離度均>1.5,其他成分對待測成分的測定無干擾,理論板數(shù)以芍藥內(nèi)酯苷峰計不低于5 000,色譜圖詳見圖1。

    2.4 線性關(guān)系考察

    分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1、2、4、5 mL,置于不同5 mL量瓶中,70%甲醇稀釋至刻度,制得6個不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線,計算各成分的回歸方程。結(jié)果各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好,結(jié)果見表1。

    2.5 檢測限與定量限考察

    精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量,倍比稀釋后,每個質(zhì)量濃度均按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時,得檢測限;當信噪比為10 ∶ 1時,得定量限,結(jié)果見表1。

    2.6 精密度試驗

    精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量,在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖。測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.63%、0.35%、1.02%、0.28%、0.85%、0.95%、1.13%、0.92%、0.86%、0.61%(n=6),相對保留時間的RSD均小于0.41%(n=6),表明儀器精密度良好。

    2.7 重復(fù)性試驗

    取同一批樣品6份,按“2.2.3”項下方法平行操作制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨峰面積的RSD均小于2.00%(n=6),相對保留時間的RSD均小于0.60%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

    2.8 穩(wěn)定性試驗

    取同一供試品溶液,分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、12、24 h后,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.48%、1.57%、2.15%、1.33%、2.27%、1.88%、2.95%、3.48%、2.87%、2.24%(n=7),相對保留時間的RSD均小于0.73 %(n=7),表明樣品在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.9 加樣回收試驗

    精密吸取已知含量的標準煎液,共6份,每份15 mL,分別置于50 mL的量瓶中,各加入待測成分對照品適量,按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件下進樣測定,記錄峰面積并計算各成分的加樣回收率和RSD值。結(jié)果,芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨的平均加樣回收率為97.72%~100.60%,RSD為0.80%~2.49%(n=6),表明該方法準確度良好,結(jié)果見表2。

    2.10 樣品含量測定

    按照“2.2.1”項下方法制備3批溫經(jīng)湯標準煎液,再按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,計算3批標準煎液中10種成分的含量,結(jié)果見表3。

    3 討論

    3.1 檢測波長的選擇

    筆者試驗前期采用二極管陣列檢測器在190~400 nm波長范圍內(nèi)對10種成分進行光譜掃描,結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨的最大吸收波長分別為228、230、250、245、315、275、285、290、274、255 nm。結(jié)合各成分的光譜圖,發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸在240 nm波長處均有較大的吸收;甘草素、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸銨在275 nm波長處均有較大的吸收。再結(jié)合液相色譜圖,最終將波長設(shè)定為0~25 min為240 nm,25~65 min為275 nm。

    3.2 流動相的選擇

    筆者首先考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等常用的流動相系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水溶液在分離效果上要優(yōu)于其他3個流動相系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上對流動相的濃度和比例進行優(yōu)化,結(jié)果表明以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相時分離效果最好,出峰穩(wěn)定、峰形尖銳,故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為本研究的流動相體系。

    3.3 標準煎液中多成分同時測定的思考

    本研究在建立溫經(jīng)湯標準煎液中多成分同時測定的方法時,僅考察了240、275 nm波長下各成分吸收情況,在此波長條件下,難以全面評價溫經(jīng)湯標準煎液的質(zhì)量。如復(fù)方中的人參皂苷類成分在203 nm波長下響應(yīng)較好,與樣品中其他成分的檢測波長差異較大,一次進樣切換波長不能體現(xiàn)標準煎液中的人參皂苷類成分;但“2.1”項下洗脫程序在203 nm波長下檢測時,人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離效果不佳,在兼顧復(fù)方各類成分的分離情況下,沒能體現(xiàn)出人參皂苷類成分對復(fù)方的貢獻,故以后在溫經(jīng)湯標準煎液的質(zhì)量控制中需另選方法測定復(fù)方中的人參皂苷類成分。

    綜上所述,本研究建立的含量測定方法適用于經(jīng)典名方溫經(jīng)湯中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷等10種成分含量的同時測定。但復(fù)方中藥味較多,有效成分較復(fù)雜,有些有效成分未能在圖譜中顯示,有些成分的結(jié)構(gòu)也沒能確定,這些問題還需要結(jié)合質(zhì)譜等分析技術(shù)進行深入研究。

    參考文獻

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    (收稿日期:2018-05-10 修回日期:2018-07-16)

    (編輯:林 靜)

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