黃芩水煎液及黃芩苷抗大鼠肝纖維化藥效作用比較研究

孟洪宇 常虹

摘要 目的：探討比較黃芩水煎液及黃芩苷對(duì)肝纖維化大鼠的防治作用及量效關(guān)系。方法：采用皮下注射四氯化碳（CCL4）8周誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，并同時(shí)灌胃給予高、中、低劑量的黃芩水煎液及黃芩苷，給藥結(jié)束后，檢測(cè)大鼠肝臟病理組織形態(tài);試劑盒檢測(cè)肝臟HYP，血清肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALP、GGT）及肝組織勻漿及血清SOD、MDA水平;放免法檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)（HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN）。結(jié)果：與模型組比較，中、低劑量黃芩水煎液及黃芩苷均能有效改善大鼠肝功能，降低血清HA、LN、PCⅢ水平及肝臟HYP含量，提高血清及肝組織SOD，降低MDA水平，并尤以低劑量組作用佳，但黃芩水煎高劑量組具有加重肝損傷趨勢(shì)。結(jié)論：中、低劑量黃芩水煎液及黃芩苷均能有效改善大鼠肝纖維化，其機(jī)制可能與其抗氧化能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芩水煎液;黃芩苷;肝纖維化

Comparison Study on Inhibitory Effects of Raix Scutellariae Decoction and Baicalin on Hepatic Fibrosis Rats

Meng Hongyu1， Chang Hong2

（1 Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China; 2 School of Pharmacy，

Baotou Medical College， Baotou 014060， China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effect and dose-effect relationship of Raix Scutellariae decoction and Baicalin on hepatic fibrosis （HF） rats. Methods：HF rat model was established by subcutaneous injection of CCL4 for .8 weeks. Meanwhile， different doses of Raix Scutellariae decoction and Baicalin were administered. Histomorphology of liver tissue was observed. Liver HYP from hepatic tissue， the serum levels of ALT， AST， ALP， GGT， the liver and serum levels of SOD and MDA were detected by Kit. The liver fibrosis indexes including HA， PC-Ⅲ， C-Ⅳ and LN were measured by radioimmunoassay. Results：As compared with those in model group， the liver content of HYP， the serum levels of HA， LN， PCⅢ， the serum and liver levels of MDA， SOD were significantly changed in middle and low dose of Raix Scutellariae decoction and Baicalin groups， which also could significantly improve hepatic function. Additionally， the middle and low dosages were beneficial. However， the high dosage of Raix Scutellariae decoction could obviously aggravate liver injury. Conclusion：Middle and low dose of Raix Scutellariae decoction and Baicalin can effectively improve HF in rats and the action may be completed by antagonizing lipid peroxidation.

Key Words Raix Scutellariae decoction; Baicalin; Hepatic fibrosis

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.039

肝纖維化主要是指各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的一種病理過程[1]。它是肝硬化及各種終末期肝病復(fù)雜病癥發(fā)生的基礎(chǔ)，但也是其早期可逆階段[2]。因此，開發(fā)安全有效的抗肝纖維化藥物進(jìn)行早期防治，甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化已成為亟需解決的問題。黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效[3];臨床常用清肝膽濕熱，為黃疸常用藥[4]。黃芩具有抗炎、抗菌、保護(hù)肝臟等廣泛的藥理活性，研究證實(shí)黃芩具有顯著的抗纖維化作用，但多數(shù)研究集中于黃酮類有效成分黃芩苷[5-8]，其他有效成分如多糖類等也亦有較強(qiáng)活性如抗氧化作用[9]，因此本實(shí)驗(yàn)通過比較不同劑量黃芩水煎液及黃芩苷對(duì)肝纖維化的防治作用，以及相應(yīng)的量效關(guān)系，為開發(fā)抗纖維化藥物及黃芩臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠90只，體重170～200 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部），許可證號(hào)SCXK（京）2011-0012。

1.1.2 藥物 黃芩飲片（批號(hào)14101608，內(nèi)蒙古騰翔中藥飲片公司）;黃芩苷（批號(hào)20150306，西安沃森生物科技有限公司）;水飛薊素膠囊（批號(hào)131102819，德國博士大藥廠）;CCL4（批號(hào)20091217，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）;特級(jí)初榨橄欖油（批號(hào)20150123，山東魯花集團(tuán)有限公司）;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）試劑盒均購自美國貝克曼公司;超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)20150505）、丙二醛（MDA，批號(hào)20150421）、羥脯氨酸（HYP，批號(hào)20150527）、總蛋白定量測(cè)定（批號(hào)20150519）試劑盒均購自南京建成;HA、LN、PCⅢ、CⅣ（批號(hào)20151020，北京北方生物技術(shù)研究所有限公司）。

1.1.3 試劑與儀器 AU640全自動(dòng)生化分析儀（日本奧林巴斯公司）;XH6080放免儀（西安核儀廠）;酶標(biāo)儀（美國賽默飛）;NP-T生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（孝感市諾普電子科技有限責(zé)任公司）;NP-B型生物組織包埋機(jī)（孝感市諾普電子科技有限責(zé)任公司）;RM2235切片機(jī)（德國徠卡公司）;CX31顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將90只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為9組，每組10只。分別為對(duì)照組、模型組、黃芩水煎液高（De-h）、中（De-m）、低（De-l）劑量組，黃芩苷高（Bai-h）、中（Bai-m）、低劑量組，陽性對(duì)照水飛薊素（Y）組。模型組及各給藥組大鼠按3 mL/kg（首次5 mL/kg）腹部皮下注射40% CCL4橄欖油液，2次/周，持續(xù)8周;對(duì)照組注射等量橄欖油液。造模同時(shí)給藥，De-h、De-m、De-l組分別以3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg灌胃給予黃芩水煎液;Bai-h、Bai-m、Bai-l分別以25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg給予黃芩苷水溶液;Y組以50 mg/kg灌胃給藥;模型組和對(duì)照組按大鼠體重5 mL/kg灌胃給予生理鹽水。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）病理組織學(xué)檢查：各實(shí)驗(yàn)組待8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉處死后于肝右葉中部切取1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm大小肝組織一塊置于多聚水合氯醛中固定;進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，行蘇木精伊紅染色（HE）染色，光鏡下觀察切片情況，描述肝臟病理變化。2）肝功能指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)8周后，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃，3 000 r/min離心，分離上層血清，以全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)。3）肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)，放免法檢測(cè)HA，LN，PCⅢ及CⅣ。4）肝組織HYP檢測(cè)：比色法測(cè)定肝組織勻漿HYP，以酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。5）抗氧化指標(biāo)的測(cè)定：酶標(biāo)儀檢測(cè)血清及肝組織MDA及SOD。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，體重穩(wěn)定增加;模型組大鼠第2周精神萎靡、體毛蓬松、進(jìn)食減少、大便稀溏，體重增長緩慢，4周之后，大鼠精神狀態(tài)改善，但皮膚出現(xiàn)潰爛;黃芩水煎高劑量組前2周大鼠尿量增加，大便稀溏，體重下降，體毛發(fā)黃，隨后逐漸改善，體重增長穩(wěn)定;黃芩水煎中、低劑量組，黃芩苷各劑量組及水飛薊素組大鼠精神狀態(tài)較模型組有改善。

2.2 黃芩對(duì)肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)影響

2.2.1 肝組織大體形態(tài)改變 對(duì)比實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)各組肝組織形態(tài)，結(jié)果顯示正常對(duì)照組大鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)嫩;模型組肝臟表面顆粒樣變嚴(yán)重，有花斑樣改變，質(zhì)硬，邊緣鈍有些大鼠肝臟甚至由于產(chǎn)生大量再生結(jié)節(jié)與其他臟器黏連。各給藥組情況較模型組改善。

2.2.2 HE染色分析 圖1為HE染色結(jié)果：對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)周圍纖維化并且大量增生，將肝小葉分割包繞成假小葉，肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，并有炎性細(xì)胞浸潤;De-h組（圖1C）肝組織結(jié)構(gòu)未見改善，仍有假小葉，但De-m、De-l組（圖1D，E）大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善，尤以低劑量組效果佳。黃芩苷各劑量組（圖1F，G，H）大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)也得到修復(fù)，膠原纖維增生減少，仍以中、低劑量改善程度佳。陽性藥物（圖I）水飛薊素組雖得到改善，但效果低于黃芩水煎液及黃芩苷中、低劑量組。提示黃芩對(duì)肝臟具有一定保護(hù)作用，可減少膠原的增生，減輕肝損傷，但要注意劑量的選擇。

2.3 黃芩對(duì)肝纖維化大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP、GGT的影響 圖2結(jié)果顯示，模型大鼠各血清指標(biāo)較對(duì)照組均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組均能顯著降低血清ALP水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且Bai-l組與對(duì)照比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但De-l組則加重肝纖維化大鼠ALT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示高劑量黃芩水煎液有肝損傷作用;De-l、Bai-l組均可有效降低AST水平（分別P<0.05，P<0.01），且Bai-l組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Bai-m、Bai-l及陽性藥物組可有效降低GGT水平（分別P<0.05，P<0.01，P<0.01），且與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。從黃芩對(duì)這些肝功能指標(biāo)的影響結(jié)果可見，中、低劑量黃芩水煎液及黃芩苷均能有效改善大鼠肝臟功能，尤以低劑量組效果最佳，且綜合比較優(yōu)于陽性藥物組，但高劑量的黃芩水煎液可能具有肝損傷作用，與病理結(jié)果一致。

圖1 肝組織HE染色病理形態(tài)結(jié)果（100倍）

注：（A）對(duì)照組;（B）模型組;（C-E）黃芩水煎液高、中、低劑量組;（F-H）黃芩苷高、中、低劑量組;（I）陽性藥物組。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖2 不同組對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST、

ALP、GGT的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 黃芩對(duì)肝纖維化大鼠血清HA，LN，PCⅢ及CⅣ的影響 圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，De-l、Bai-m、Bai-l組及陽性藥物組均能顯著降低血清HA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但Bai-h組則顯著增高HA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，僅Bai-l組及陽性藥物組能夠顯著降低LN水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且黃芩苷低劑量組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），優(yōu)于陽性藥物組;De-l、Bai-m、Bai-l組及陽性藥物組與模型組比較，均能顯著降低PCⅢ水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 不同組對(duì)肝纖維化大鼠血清HA，

LN，PCⅢ及CⅣ的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.5 黃芩對(duì)肝纖維化大鼠肝組織HYP的影響 圖4結(jié)果顯示與正常組比較，模型組大鼠HYP值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組除De-h、Bai-h組，其余各組均能顯著降低HYP水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 不同組對(duì)肝纖維化大鼠肝組織HYP的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.6 黃芩對(duì)肝纖維化大鼠血清及肝組織勻漿SOD，MDA的影響 圖5結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清和肝組織SOD顯著降低，血清和肝組織MDA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，黃芩水煎及黃芩苷各劑量組能夠顯著降低血清及肝組織MDA水平（P<0.01），除De-h組，各組均能顯著提高血清及肝組織SOD水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雖De-h組未能顯著提高肝纖維化大鼠抗氧化能力，但仍有改善趨勢(shì)，與病理及血清肝纖維化指標(biāo)所示結(jié)果不呈正相關(guān)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)黃芩能夠通過抗氧化作用，改善肝功能和肝纖維化。

圖5 不同組對(duì)肝纖維化大鼠肝組織

及血清SOD、MDA的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

肝纖維化是由于膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝內(nèi)合成與降解失衡，造成過多沉積而形成[10]。透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型前膠原蛋白（CⅣ）是構(gòu)成ECM的主要成分，其中HA屬于ECM中蛋白多糖，能較早反映肝細(xì)胞損傷，是反映肝纖維化的敏感指標(biāo);LN是一種細(xì)胞外基質(zhì)非膠原糖蛋白;PCⅢ是ECM的主要成分，能夠較好的反映肝纖維化程度，也是目前研究最多反映肝纖維化活動(dòng)性的血清標(biāo)志物;CⅣ是基底膜的主要成分[11]。這4個(gè)指標(biāo)聯(lián)合能較為客觀的反映肝纖維化程度，用于臨床纖維化疾病的診斷與療效評(píng)價(jià)。HYP為膠原蛋白分子所特有，約占膠原蛋白氨基酸總量的13.4%，它的含量可以反映膠原代謝情況而直接反映肝臟纖維化程度[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的黃芩水煎劑及黃芩苷能夠不同程度的降低血清HA、LN、PCⅢ水平，尤以Bai-l組最佳，其中De-h更加重HA升高，可能為其加重肝纖維化的機(jī)制之一。黃芩水煎液和黃芩苷的中、低劑量組及陽性藥物組能夠不同程度的降低HYP水平，尤以黃芩苷低劑量組最佳。推測(cè)中低劑量的黃芩能夠通過減少ECM過度堆積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。同樣作為診斷肝纖維化“金標(biāo)準(zhǔn)”的病理結(jié)果同樣顯示，除De-h組，各給藥組均有不同改善，且黃芩苷高劑量組作用低于黃芩苷中低劑量組，提示對(duì)于黃芩苷及黃芩水煎液均有抗纖維化作用，但不與劑量呈正相關(guān)，大劑量可能有肝損傷，應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意量的選擇。

氧化應(yīng)激是纖維化發(fā)生的重要機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)會(huì)釋放活性氧物質(zhì)，引起炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，釋放眾多促纖維化因子，而引起的ECM的堆積[13]。SOD是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一類重要的過氧化物分解酶，是機(jī)體抗過氧化能力指標(biāo)之一。MDA是一種氧化應(yīng)激因子是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)藥物對(duì)模型大鼠提升SOD、清除MDA的能力，來評(píng)價(jià)藥物抗氧化能力，揭示其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩水煎劑及黃芩苷組各劑量均能降低肝纖維化大鼠血清和肝組織MDA水平，除De-h組均能提高血清及肝組織SOD水平;提示黃芩能夠通過抗氧化作用抗肝、肺纖維化。

本研究通過對(duì)比黃芩水煎液及黃芩苷對(duì)肝纖維化大鼠作用，發(fā)現(xiàn)中、低劑量黃芩具有良好的抗纖維化作用，總體而言，黃芩苷優(yōu)于水煎液，其作用機(jī)制及大劑量肝損傷機(jī)制有待深入研究。

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