豬CD 127流式單克隆抗體的研制

趙久剛　楊溢歡　潘紅梅　朱丹　龍熙　涂志　張鳳鳴　郭宗義　陳四清　藍(lán)靜

摘要：[目的]研制出豬CDl27（調(diào)節(jié)因子IL-7受體α鏈）流式單克隆抗體，為研究分析豬淋巴細(xì)胞亞群，尤其是豬Treg細(xì)胞亞群提供流式細(xì)胞分析抗體，也為進(jìn)一步探究豬抗病性狀與免疫機(jī)制間的關(guān)系打下基礎(chǔ)。[方法]克隆豬CDl27基因片段，通過(guò)原核載體誘導(dǎo)表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，以純化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，然后取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，綜合ELISA和流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選出亞克隆抗體，并采用Western blotting驗(yàn)證所得亞克隆抗體能否與豬淋巴細(xì)胞上的CD127特異性結(jié)合。[結(jié)果]豬CD127基因eDNA全長(zhǎng)1999 bp，第49M428 bp為開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼459個(gè)氨基酸，其中前21位氨基酸為信號(hào)肽，成熟肽N端第1～219位氨基酸為胞外蛋白，第220～242位氨基酸為跨膜蛋白，第243--459位氨基酸為胞內(nèi)蛋白。以pET28a和pET32a原核載體誘導(dǎo)表達(dá)CDl27胞外片段可獲得大小介于34～43 kD的融合蛋白，經(jīng)Ni親和層析柱純化后用于免疫Balb/c小鼠，6只免疫小鼠血清中的多克隆抗體均能對(duì)豬淋巴細(xì)胞中的CD3陽(yáng)性細(xì)胞（CD3⁺）進(jìn)行共標(biāo)記，其中以M25和M4兩只免疫小鼠抗血清對(duì)CD3⁺的共標(biāo)記效果較優(yōu)，分群清晰；但流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅2.3%的CD3⁺能與M2混合池培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體共標(biāo)記，而67.0%的CD3⁺能與M4混合池培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體共標(biāo)記，且分群清晰。從M4混合池中篩選出6株效價(jià)穩(wěn)定的亞克隆細(xì)胞株（1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4E1），且以1D8、2F3、2F8和13C6亞克隆抗體標(biāo)記的CD3⁺較多，其培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體在豬胸腺和肌肉樣品中均能檢測(cè)出大小約50 kD的單一目的條帶。[結(jié)論]制備獲得的豬CD127流式單克隆抗體可與T淋巴細(xì)胞表面的IL-7受體特異性結(jié)合，同時(shí)在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)程中可用于豬Treg細(xì)胞亞群檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：豬；CD127；單克隆抗體；Treg細(xì)胞；ELISA；流式細(xì)胞儀檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0572-08

0引言

[研究意義]CDl27是外周成熟T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持調(diào)節(jié)因子IL-7在T淋巴細(xì)胞上應(yīng)答的受體α鏈，是T淋巴細(xì)胞表面的重要標(biāo)志物（Carrette and Surh，2012）。IL-7受體由α和γ鏈構(gòu)成，其中，γ鏈?zhǔn)荌L2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21的通用受體，能與這些調(diào)節(jié)因子相互結(jié)合并發(fā)揮相應(yīng)的功能作用（Matthews eta1.，1995）；α鏈（CDl27）則是與調(diào)節(jié)因子IL7特異結(jié)合并對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控的胞外受體，因此淋巴細(xì)胞對(duì)IL-7的特異性應(yīng)答主要由CDl27表達(dá)調(diào)控（Ri-beiro et a1.，2014）。淋巴細(xì)胞表面的CDl27表達(dá)調(diào)控貫穿于整個(gè)淋巴細(xì)胞的調(diào)控周期，尤其在胸腺細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟過(guò)程中，CDl27對(duì)維持胞內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞存活均發(fā)揮著重要作用（孫晨鳴等，2007）。因此，加強(qiáng)對(duì)CDl27表達(dá)及相關(guān)生物分子應(yīng)答機(jī)制的研究，對(duì)深入了解T淋巴細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程細(xì)胞因子的互作機(jī)制及其在免疫系統(tǒng)中的生物學(xué)功能具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是T淋巴細(xì)胞中具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，在維持機(jī)體自身免疫耐受和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面具有重要作用（Afzali et a1.，2007）。Treg細(xì)胞通常具有CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺的特性，特別是作為叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一的FoxP3被認(rèn)為是最具特異性的Treg細(xì)胞標(biāo)志物（Zhou et a1.，2009）。但由于FoxP3為胞內(nèi)蛋白，其表達(dá)發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)記時(shí)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定并穿孔，因而難以在保持細(xì)胞活性的同時(shí)利用FoxP3進(jìn)行Treg細(xì)胞檢測(cè)和分選。在Treg細(xì)胞中，胞內(nèi)的FoxP3與胞外的CDl27表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（Liu et a1.，2006；Zhou et al_，2009）。此外，Hartigan-O'Connor等（2007）、蔡光強(qiáng)等（2016）研究證實(shí)，CD127的啟動(dòng)子上具有FoxP3結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)oxP3蛋白表達(dá)后可結(jié)合到CD127的啟動(dòng)區(qū)而導(dǎo)致CD127表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明Treg細(xì)胞同時(shí)具有CD127表達(dá)量較低的特征。根據(jù)這一特性，科研人員通常以CD127作為細(xì)胞表面標(biāo)記物用于Treg細(xì)胞的分離檢測(cè)，即T淋巴細(xì)胞具備CD4⁺CD25⁺CD127^low特征時(shí)，可定義其為T(mén)reg細(xì)胞。利用這一特征檢測(cè)分離得到的Treg細(xì)胞不僅能保持細(xì)胞的完整性和活力，還可進(jìn)行下一步的培養(yǎng)及生物學(xué)功能檢測(cè)（Hartigan-O'Connor et a1.，2007）。可見(jiàn)，CDl27抗體對(duì)T淋巴細(xì)胞分型，特別是Treg細(xì)胞分型至關(guān)重要（王會(huì)平等，2008；劉芳等，2016）。[本研究切入點(diǎn)]流式細(xì)胞術(shù)分析已發(fā)展成為免疫學(xué)研究的一個(gè)常規(guī)手段，是分析淋巴細(xì)胞亞群及檢測(cè)各亞群功能必不可少的研究技術(shù)（劉濤等，2008）。該技術(shù)對(duì)抗體的特異性要求較高，不同種屬來(lái)源的流式抗體通常不能通用（Reggeti and Bienzle，2011），且目前可用于檢測(cè)豬淋巴細(xì)胞的相關(guān)流式抗體相對(duì)較少，市場(chǎng)上尚無(wú)針對(duì)豬淋巴細(xì)胞的CDl27商業(yè)抗體銷售。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]克隆豬CDl27基因片段并通過(guò)原核載體誘導(dǎo)表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，然后利用純化獲得的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，結(jié)合ELISA與流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選出單克隆抗體，為研究分析豬淋巴細(xì)胞亞群，尤其是豬Treg細(xì)胞亞群提供流式細(xì)胞分析抗體，也為進(jìn)一步探究豬抗病性狀與免疫機(jī)制問(wèn)的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

豬胸腺eDNA模板由農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以長(zhǎng)白豬胸腺組織提取總RNA合成；F8 FastLong PCR Master Mix購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，pMDl9-T載體購(gòu)自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司，抗豬CD3熒光抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，聚乙二醇（PEG）及其他生化試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2豬CD127基因序列分析

根據(jù)GenBank中豬CDl27基因的mRNA序列（NM 001146128.2）及其蛋白序列（NP 001139600.1），采用SignalP 4.1 Server分析豬CDl27蛋白序列并預(yù)測(cè)其蛋白信號(hào)肽（Petersen et a1.，2011），通過(guò)ExPASyProtParam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）計(jì)算剪切后蛋白的分子量和等電點(diǎn)，跨膜結(jié)構(gòu)域以TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/servic-es/TMHMM/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后綜合上述分析結(jié)果獲取豬CD127基因的胞外片段。

1.3豬CD127基因克隆

根據(jù)豬CD127基因序列胞外片段，設(shè)計(jì)引物（P1：5-GGATCCAGTGGCTATGCAGAGAATGGAG-3.P2：5-CTCGAGTCAAGGATCCACCTCCCCTGTG-3）。以豬胸腺cDNA為模板，PCR擴(kuò)增豬CDl27蛋白序列（NP 001139600.1）第22～240位共219個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的cDNA序列，PCR反應(yīng)體系50.0μL：cDNA模板1.0μL，25.0μL F8 Fast Long PCR Mater Mix，上、下游引物各1.0μL，ddH20 22.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃15 s，55℃15 s，72℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確后切膠，并以DNA回收試劑盒回收備用。

1.4基因重組與原核表達(dá)

將擴(kuò)增獲得的DNA序列經(jīng)TA克隆連人pMD 19-T載體，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。以PCR鑒定呈陽(yáng)性的克隆接種提取質(zhì)粒，用BamH I和Xho I進(jìn)行酶切，分別連接至雙酶切后的pET28a和pET32a載體上，再轉(zhuǎn)化DL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞菌株。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，挑取單克隆菌株接種于含100 μg/mL氨芐青霉素（AMP）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；次日再取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至500 mL的LB液體培養(yǎng)基（100 gg/mL AMP）中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體進(jìn)行超聲波破碎，離心后分別收集菌體上清液和沉淀，SDS-PAGE分析融合蛋白的表達(dá)情況。以8 mol/L尿素溶解誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白后進(jìn)行Ni親和層析柱純化，經(jīng)咪唑洗脫，合并濃度較高的蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5動(dòng)物免疫

將純化的融合蛋白以佛氏完全佐劑完全乳化后，按100 gg/只的劑量對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫（首免），分別于首免后7、14和28 d用經(jīng)佛氏不完全佐劑乳化后的融合蛋白繼續(xù)免疫一次；最后一次免疫3 d后采集小鼠血清，并采用ELISA檢測(cè)小鼠血清的抗體效價(jià)。同時(shí)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫小鼠抗血清與豬CD3抗體對(duì)豬血液中淋巴細(xì)胞的共標(biāo)記情況，具體操作流程如下：取豬EDTA抗凝血100.0μL，加入紅細(xì)胞裂解液裂解，800xg離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用100.0μL PBS重懸，加入10.0μL免疫小鼠抗血清作一抗；37℃孵育30 min后用PBS洗滌3次，加入AF488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗）；37℃再孵育30 min后用PBS洗滌3次，重懸細(xì)胞于100.0μL PBS中，然后加入1.0μL PE標(biāo)記的豬CD3抗體，37℃孵育10 min后PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3抗體和自制CD127抗體的共標(biāo)記情況。

1.6細(xì)胞融合及單克隆抗體篩選

取免疫小鼠脾臟組織用細(xì)胞篩網(wǎng)分離脾細(xì)胞，然后與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按1：10比例混合，1000xg離心3 min，棄上清液，振蕩細(xì)胞使其完全均勻混合后置于37℃水浴鍋中，并在45 s內(nèi)加入1 mL預(yù)熱的PEG，靜置45 s后加入10 mL RPMll640培養(yǎng)基終止反應(yīng)；1000xg離心10 min，棄上清液，加入含20%血清的HAT培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37℃培養(yǎng)48 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用作混合池進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，將M4混合池細(xì)胞懸浮混勻后分散培養(yǎng)于96孔板中，繼續(xù)篩選培養(yǎng)10 d后，以純化的融合蛋白包被，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體含量。取分泌抗體較高的細(xì)胞株用于后續(xù)篩選，直至抗體含量穩(wěn)定后，即獲得穩(wěn)定的亞克隆細(xì)胞株。取抗體含量較高且穩(wěn)定的培養(yǎng)基上清液自制CDl27抗體（一抗），利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CDl27抗體與CD3抗體的共標(biāo)記情況。

1.7CD127抗體的Western blotting驗(yàn)證

為了驗(yàn)證亞克隆細(xì)胞株分泌抗體的有效性，取長(zhǎng)白豬胸腺和肌肉組織樣品，加入RIPA Buffer后勻漿，4℃下12000xg離心5 min，取上清液，加入蛋白Loading Buffer，96℃孵育10 min后用12%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，以自制CDl27抗體為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，Western blotting檢測(cè)抗體標(biāo)記情況，具體操作流程如下：甲醇處理后的PVDF膜與SDS-PAGE膠相貼后兩面用浸泡了電轉(zhuǎn)印液的濾紙覆蓋組成三明治結(jié)構(gòu)，100 V電轉(zhuǎn)1.5 h；轉(zhuǎn)印后用5%脫脂奶粉封閉3 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入稀釋后的CD127抗體，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，加二抗（1：500）孵育1 h：TBST洗3次后以ECL顯色法顯色，采用LI-Cor化學(xué)發(fā)光成像儀掃描成像，并分析電泳條帶。

2結(jié)果與分析

2.1豬CD，27基因的分子結(jié)構(gòu)

預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，豬CDJ，27基因cDNA全長(zhǎng)1999 bp，第49～1428 bp為開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼459個(gè)氨基酸。成熟的CDl27蛋白由438個(gè)氨基酸構(gòu)成，其分子量為49 kD，等電點(diǎn)（pI）為6.52。豬cDl27蛋白的前21位氨基酸為信號(hào)肽（圖1）；成熟肽的第220～242位氨基酸為跨膜區(qū)（圖2），N端第1～219位氨基酸為胞外區(qū)，c端第243～459位氨基酸為胞內(nèi)區(qū)。

2.2豬CDl27融合蛋白的原核表達(dá)與純化結(jié)果

經(jīng)PCR和雙酶切作用，將豬cDl27蛋白第22～240位（成熟肽第1～219位）肽段（含219個(gè)氨基酸）對(duì)應(yīng)的cDNA克隆重組至pET28a和pET32a載體上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大小介于34～43 kD的融合蛋白（圖3），且融合蛋白以包涵體形式表達(dá)為主。其中，pET28a原核載體的表達(dá)量高于pET32a原核載體（圖3-A）。將pET28a原核載體表達(dá)的融合蛋白包涵體用8 mol/L尿素溶解后，Ni親和層析柱純化后得到純度較高的豬cDl27融合蛋白（圖3-B），可用于后續(xù)的小鼠免疫。

2.3 Balb/c小鼠免疫結(jié)果

采用純化后的CDl27融合蛋白免疫6只Balb/c小鼠，經(jīng)4次免疫后采集小鼠血清，以ELIsA檢測(cè)其血清抗體效價(jià)，結(jié)果表明，6只免疫小鼠血清抗體對(duì)cDl27融合蛋白的滴度均大于1：80000（表1）。以免疫小鼠抗血清為一抗進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示6只免疫小鼠血清中的多克隆抗體均能對(duì)豬淋巴細(xì)胞中的CD3陽(yáng)性細(xì)胞（CD3⁺）進(jìn)行共標(biāo)記。其中，

2.4小鼠脾細(xì)胞融合結(jié)果

取M2和M4小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合培養(yǎng)，得到兩只小鼠的融合細(xì)胞混合池，取混合培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，兩株混合池細(xì)胞均能分泌抗豬CD127的抗體。M2和M4混合池培養(yǎng)基上清液原倍ELISA檢測(cè)的OD分別為2.813和2.713（陰性對(duì)照為0.088和0.079）。同時(shí)，將培養(yǎng)基上清液1：100稀釋作為抗CDl27抗體，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與CD3⁺的共標(biāo)記情況，結(jié)果（圖5）顯示，僅2.3%的CD3⁺能與M2混合池培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體共標(biāo)記，而67.0%的CD3⁺能與M4混合池培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體共標(biāo)記，且分群清晰。

2.5單克隆抗體篩選結(jié)果

取M4混合池細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行單克隆抗體篩選，以ELISA篩選穩(wěn)定表達(dá)CDl27抗體的亞克隆細(xì)胞株，結(jié)果共獲得6株效價(jià)穩(wěn)定的亞克隆細(xì)胞株，分別為1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4El。以這些亞克隆細(xì)胞株培養(yǎng)基上清液為CDl27抗體，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與CD3⁺的共標(biāo)記情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各亞克隆抗體均可標(biāo)記部分CD3⁺（圖6）。1D8、2F3、2F8和3C6亞克隆抗體標(biāo)記的CD3⁺較多，其中又以2F8亞克隆抗體標(biāo)記的CD3⁺分群較清晰。

2.6亞克隆分泌抗體Western blotting檢測(cè)結(jié)果

以Westem blotting檢測(cè)1D8、2F3、2F8和3C6亞克隆細(xì)胞株培養(yǎng)基上清液中分泌抗體，結(jié)果顯示，4株亞克隆細(xì)胞株分泌的抗體在胸腺和肌肉樣品中均能檢測(cè)出大小約50 kD的單一目的條帶（圖7），且在胸腺樣品中該蛋白的表達(dá)量高于肌肉樣品。

3討論

白細(xì)胞分化抗原（Cluster and（1ifferentiation，cD）是各類白細(xì)胞在發(fā)育分化過(guò)程中表達(dá)的表面分子，有的在不同階段出現(xiàn)或消失，有的持續(xù)終身，在細(xì)胞發(fā)育分化和成熟白細(xì)胞執(zhí)行功能的過(guò)程中發(fā)揮著不同的功能作用（Mokhtarzadeh et a1.，2017）。因此，常用白細(xì)胞不同亞群在不同發(fā)育階段表達(dá)不同CD的特性來(lái)鑒定和研究白細(xì)胞功能（zola et a1.，2006）。cDl27是普遍存在于多數(shù)T淋巴細(xì)胞表面的一種具有重要功能的表面抗原，在原始T淋巴細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化和成熟的過(guò)程中，其表達(dá)量因受抑制而下調(diào)。這一特征使得CD127成為研究Treg細(xì)胞的一個(gè)重要工具。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，通常使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定和分離免疫細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞是淋巴細(xì)胞免疫的重要組分之一，能通過(guò)分泌細(xì)胞因子抑制其他免疫細(xì)胞的活性，進(jìn)而在限制自身免疫、防止機(jī)體對(duì)外界刺激產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用（Palomares et a1.，2010）。在CD127商業(yè)抗體出現(xiàn)前，研究學(xué)者主要利用CD4+CD25+FoxP3+鑒定Treg細(xì)胞，分離Treg細(xì)胞時(shí)只能利用胞外的CD4和CD25進(jìn)行分類，導(dǎo)致部分非Treg細(xì)胞也被收集進(jìn)來(lái)，降低了所獲細(xì)胞的純度。目前，由于缺乏CD127等一系列流式工具抗體，導(dǎo)致豬的各種免疫系統(tǒng)組分功能研究受限（屈雪琪等，2011），同時(shí)限制了流式細(xì)胞術(shù)在畜牧生物學(xué)研究中的應(yīng)用。

利用單克隆抗體進(jìn)行畜牧生物學(xué)的研究由來(lái)已久。本研究擬通過(guò)單克隆抗體制備結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選，獲取可供流式細(xì)胞儀檢測(cè)用的豬CD127流式工具抗體。在運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活體淋巴細(xì)胞時(shí)，通常需要用流式工具抗體識(shí)別胞外的抗原表位（Menon et a1.，2014）。為此，本研究在選取抗原蛋白肽時(shí)利用跨膜區(qū)分析，截取胞外片段進(jìn)行原核表達(dá)并用作免疫原，以期獲得可檢測(cè)活體淋巴細(xì)胞的抗體，結(jié)果表明，利用原核載體表達(dá)融合蛋白免疫6只小鼠獲得的抗血清均可將部分CD3標(biāo)記，但分群效果均較差；免疫血清抗體是多種抗體混合在一起的多克隆抗體，致使細(xì)胞表面抗原被標(biāo)記的程度也不同（Cooper and Paterson，2001），其均一性較差可能是流式標(biāo)記分群較差的主要原因之一。此外，選取M2和M4兩只免疫小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體融合與篩選，細(xì)胞融合后經(jīng)初步培養(yǎng)及鑒定，獲得M2和M4抗體混合池。在研究過(guò)程中盡管采用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)混合池中分泌有較高濃度的CD127抗體，且上清液擁有較高的ELISA檢測(cè)滴度，但最終用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，M2混合池中的抗體卻失去對(duì)豬血液淋巴細(xì)胞的標(biāo)記活性。說(shuō)明ELISA檢測(cè)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)所標(biāo)記的抗原表位存在一定差異，也提示市場(chǎng)上基于ELISA檢測(cè)篩選所制備的單克隆抗體并不完全適用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

本研究利用M4混合池進(jìn)行亞克隆抗體篩選，共獲得6株穩(wěn)定分泌抗體的亞克隆細(xì)胞株，其抗體ELISA滴度檢測(cè)結(jié)果均較高，但采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)僅2F8亞克隆抗體在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中表現(xiàn)出較好的分群效果，1D8、2F3和3C6亞克隆抗體雖能較好地標(biāo)記淋巴細(xì)胞，但分群效果相對(duì)較差。盡管目前已具備并形成單克隆抗體篩選的成熟方案（Velugula-Yellela et a1.，2017），但獲得的單克隆抗體用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)通常無(wú)法標(biāo)記目標(biāo)受體。綜合上述，由于ELISA與流式細(xì)胞儀檢測(cè)所需抗原表位的差異，因此在制備流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體時(shí)，需同時(shí)利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行同步驗(yàn)證，以確保后期獲得的單克隆抗體可用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。為了確認(rèn)所獲亞克隆抗體結(jié)合的靶標(biāo)蛋白是CD127蛋白，本研究還利用Western blotting檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示，4株亞克隆抗體均能在豬的胸腺和肌肉樣品中檢出分子量約50 kD的單一目的條帶。正常的豬CD127成熟肽分子量為49 kD，與檢出的分子量基本符合，進(jìn)一步證實(shí)了該抗體的有效性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)免疫小鼠血清中的抗體、混合池及2F8等亞克隆細(xì)胞株培養(yǎng)基上清液中的分泌抗體均能較好地與CD3⁺共標(biāo)記，故推測(cè)制備獲得的抗體在樣本檢測(cè)中所標(biāo)記的靶受體即豬CD127。

4結(jié)論

制備獲得的豬CD127單克隆抗體可與T淋巴細(xì)胞表面的IL-7受體特異性結(jié)合，同時(shí)在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)程中可用于T淋巴細(xì)胞亞群尤其是Treg細(xì)胞檢測(cè)。

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）