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    甜瓜尾孢葉斑病病原分離與鑒定

    2018-09-10 22:48:56葉云峰杜嬋娟覃斯華柳唐鏡洪日新付崗李桂芬黃金艷
    關(guān)鍵詞:葉斑病甜瓜

    葉云峰 杜嬋娟 覃斯華 柳唐鏡 洪日新 付崗 李桂芬 黃金艷

    摘要:[目的]明確近年來(lái)引起廣西大棚厚皮甜瓜葉斑病的病原,為該病害的有效防治提供參考依據(jù)。[方法]采用單孢分離法直接從罹病厚皮甜瓜葉片上分離病原菌,以離體葉片接種法驗(yàn)證病原菌的致病性。對(duì)致病菌的菌落、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行觀察,同時(shí)對(duì)致病菌的rDNA-ITS基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。[結(jié)果]病原菌形態(tài)特征與瓜類尾孢(Cercospora citrullina)基本一致,rDNA-ITS基因序列與瓜類尾孢的同源性達(dá)99%。結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征,將該病害的病原菌鑒定為瓜類尾孢。[結(jié)論]近年在廣西大棚厚皮甜瓜產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生的甜瓜葉斑病由瓜類尾孢引起,該病是廣西厚皮甜瓜上的一種新病害。

    關(guān)鍵詞:甜瓜;葉斑??;病原鑒定;瓜類尾孢

    中圖分類號(hào):S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-1191(2018)03-0476-05

    0引言

    [研究意義]甜瓜是葫蘆科黃瓜屬(CucumisLinn.)一年生蔓生草本植物,分為薄皮甜瓜和厚皮甜瓜兩大類型。厚皮甜瓜(包括哈密瓜、白蘭瓜和粗皮甜瓜等)原產(chǎn)非洲和亞洲熱帶地區(qū),我國(guó)新疆為厚皮甜瓜次生起源中心之一。廣西引進(jìn)厚皮甜瓜種植始于20世紀(jì)90年代中期,并于1998年開(kāi)始通過(guò)改用大棚保護(hù)地避雨栽培試種獲得成功,2003年后種植面積迅速擴(kuò)大,常年種植總面積約4000 ha,種植甜瓜已成為廣西部分瓜農(nóng)脫貧致富的重要途徑。由于廣西的氣候高溫多雨,大棚內(nèi)濕度大,加上大棚栽培難以實(shí)施輪作,致使大棚甜瓜生產(chǎn)受到多種病害的威脅。本課題組于2015-2016年在廣西南寧、北海和欽州等厚皮甜瓜主產(chǎn)區(qū)開(kāi)展甜瓜病害種類調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)一種葉部新病害,該病害侵染北甜一號(hào)、好運(yùn)11號(hào)和新金鳳凰等厚皮甜瓜品種,其癥狀與以往發(fā)生的甜瓜葉部病害癥狀存在明顯差異,主要表現(xiàn)為在葉片上形成近圓形或倒“V”字形褐色大型病斑。該病在春茬甜瓜上的發(fā)病率為30%~50%,在秋茬甜瓜上發(fā)生更嚴(yán)重,多數(shù)大棚發(fā)病率在80%~22z,嚴(yán)重的發(fā)病率達(dá)100%,成為2015~2016年廣西大棚甜瓜最嚴(yán)重的葉部病害之一。該病主要造成甜瓜葉片大面積枯死,植株早衰,嚴(yán)重影響果實(shí)后期的營(yíng)養(yǎng)吸收,降低果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量,造成20%~40%的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病病原菌的分類地位尚不明確,因此,開(kāi)展該病原的鑒定研究,對(duì)有效防治該病害具有重要的指導(dǎo)意義。[前人研究進(jìn)展]在我國(guó)南方地區(qū)大棚甜瓜上常發(fā)生的病害主要有霜霉病、白粉病、蔓枯病、病毒病、枯萎病、炭疽病、猝倒病和根結(jié)線蟲(chóng)病等(何毅等,2005;周靈芝等,2006)。經(jīng)比對(duì),本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)的甜瓜葉部新病害癥狀與上述常見(jiàn)病害的葉部癥狀存在明顯差異,關(guān)于這種新病害目前未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。此外,前人對(duì)植物病害的鑒定通常采用病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法,該方法能將病原菌鑒定到種的水平(王爽等,2013;冉雙飛等,2016;趙楊等,2016;歐陽(yáng)秋飛等,2017)。[本研究切入點(diǎn)]對(duì)于一種新發(fā)生的病害,準(zhǔn)確鑒定其病原菌是進(jìn)行有效防治的基本前提。目前對(duì)近年來(lái)廣西大棚甜瓜葉片上發(fā)生的新病害尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]采用單孢分離法對(duì)厚皮甜瓜上新發(fā)生的葉部病害進(jìn)行病原菌分離,用離體葉片接種法進(jìn)行致病性測(cè)定,同時(shí)對(duì)病原菌的形態(tài)特征進(jìn)行顯微觀察,并對(duì)其rDNA-ITS基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析,結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行鑒定,以明確該病原菌的分類地位,為該病害的有效防治提供參考依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    病原菌分離和接種均采用厚皮甜瓜品種好運(yùn)11號(hào),種植于廣西南寧市武鳴區(qū)鑼圩鎮(zhèn)武帽農(nóng)場(chǎng)。病原菌分離采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

    1.2病害癥狀觀察

    2015年8月~2016年12月,在南寧市武鳴區(qū)、青秀區(qū)和北海市銀海區(qū)等厚皮甜瓜主產(chǎn)區(qū),于不同發(fā)病時(shí)期對(duì)厚皮甜瓜葉斑病進(jìn)行癥狀觀察、記錄和拍照。

    1.3病原菌鑒定

    1.3.1病原菌分離 從南寧市武鳴區(qū)鑼圩鎮(zhèn)武帽農(nóng)場(chǎng)5個(gè)大棚采集新鮮病葉各1張,分別用滅菌水沖洗表面,置于28℃下保濕2 d,在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行病原菌單孢分離。用沾了無(wú)菌水的滅菌接種環(huán)粘取病斑處的分生孢子,在水瓊脂塊表面劃線,置顯微鏡下觀察,挑取單孢子移入另一塊水瓊脂塊表面,再次用顯微鏡觀察,確認(rèn)第2塊水瓊脂塊上只含有1個(gè)分生孢子,將第2塊水瓊脂塊移到PDA培養(yǎng)基上,28℃下黑暗培養(yǎng)10 d,挑取菌落邊緣的菌絲塊轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)10 d后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2病原菌致病性測(cè)定 從生長(zhǎng)健壯的甜瓜植株中上部剪取健康葉片,用無(wú)菌水沖洗干凈。用滅菌接種針在健康葉片上的每個(gè)接種點(diǎn)針刺5下,在傷口處滴半滴無(wú)菌水。從28℃黑暗培養(yǎng)15 d的菌落上切取菌絲塊(5 mm×5mm),將長(zhǎng)菌絲的一面貼于針刺傷口處。每處理3張葉片,每張葉片接種3個(gè)菌絲塊;以針刺傷口處貼放PDA空白培養(yǎng)基塊為對(duì)照。將處理和對(duì)照葉片置于28℃下保濕培養(yǎng),定期觀察各處理葉片的發(fā)病情況。發(fā)病后對(duì)病斑上的病原菌進(jìn)行再分離,比較分離菌株與接種菌株的菌落和分生孢子形態(tài)是否相同,如分離菌株與接種菌株的菌落和分生孢子形態(tài)相同,則說(shuō)明是同一種真菌,可確認(rèn)為病原菌。

    1.3.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將致病菌接種到PDA培養(yǎng)基上,置于28℃下黑暗培養(yǎng),定期觀察記錄菌落的形態(tài)特征和生長(zhǎng)情況。另外,用滅菌解剖刀片從葉片病斑上刮下菌體,置于載玻片上的半滴無(wú)菌水中,蓋上蓋玻片,置顯微鏡下觀察病菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)特征,并測(cè)量大小。

    1.3.4病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA。以真菌通用引物ITS1(5-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(朱迎迎等,2016)對(duì)病原菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 uL:2.5 mmol/L dNTP 2.0μL,10xBuffer 2.5μL,5 U/IaLEx Taq 0.5 μL,10 μmol/L ITS1和ITS4各1.0μL,模板DNA 100 ng,超純水補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃30 s,58℃30 s,72℃80 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,回收目標(biāo)DNA條帶,送交金唯智生物科技(北京)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。運(yùn)用BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1病害癥狀

    該病害在厚皮甜瓜定植后的整個(gè)生育期均可發(fā)生,苗期發(fā)生較輕微,以生長(zhǎng)中后期(結(jié)果期至采收期)發(fā)病最重。病害癥狀首先在植株下部的葉片上出現(xiàn),隨后向中上部葉片擴(kuò)展。初期在葉片上形成灰白色圓形小斑點(diǎn),后逐漸擴(kuò)大成近圓形褐色病斑,病斑中央常為灰白色,外圍有明顯黃色暈圈(圖1-A)。還可形成不規(guī)則形或沿著葉緣葉脈向葉片內(nèi)部擴(kuò)展呈倒“V”字形的大型病斑,病斑均為褐色,外圍有黃色暈圈(圖1-B),病斑大小差異較明顯。病害嚴(yán)重時(shí),多個(gè)病斑融合在一起,致葉片大面積干枯死亡,造成植株早衰。

    2.2病原菌分離和鑒定結(jié)果

    2.2.1病原菌分離和致病性測(cè)定結(jié)果 對(duì)5張來(lái)自不同大棚的甜瓜病葉進(jìn)行病原菌單孢分離,分離純化得到形態(tài)特征一致的真菌5株。通過(guò)針刺接種法將5株菌株的菌絲塊接種到健康的甜瓜葉片上,接種4 d后,接種部位均出現(xiàn)明顯的近圓形褐色小病斑,直徑8-10 mm,外圍有明顯黃色暈圈(圖2-B)。隨著時(shí)間推移,病斑不斷擴(kuò)大,接種6 d后,病斑直徑達(dá)25-30 inn3,病斑癥狀與自然發(fā)病的近圓形病斑癥狀相似(圖2-C)。對(duì)照葉片未發(fā)?。▓D2-A)。從發(fā)病組織上采用單孢分離法再分離得到的菌株,其菌落和分生孢子形態(tài)與接種菌株相同,表明再分離獲得的真菌菌株即為病原菌。選取其中一株菌株TBD-2進(jìn)行培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定。

    2.2.2病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 人工培養(yǎng)的菌落在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,28℃下黑暗培養(yǎng)10 d,菌落直徑僅為3.0-3.5 cm,且不產(chǎn)生分生孢子。菌落近圓形,邊緣平滑,氣生菌絲致密,菌落正面為白色,中央隆起(圖3-D),菌落背面黑褐色,產(chǎn)生紅色色素。菌落生長(zhǎng)特征基本與尾孢屬真菌相符(雷玉明和張建文,2006)。

    從葉片病斑上觀察到病菌子實(shí)體葉兩面生。刮下菌體制成臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀察,可見(jiàn)子座小或不明顯。分生孢子梗單生或2-12根簇生,頂部淺褐色,基部深褐色,不分枝,直立或彎曲,有1-7個(gè)曲膝狀折點(diǎn),1-8個(gè)隔膜,頂部圓錐形平截,孢痕疤明顯加厚(圖3-C),大小為(52.5-245.0)μm×(4.0-6.0)gin。分生孢子針形,直或稍彎曲,無(wú)色,單生,基部平截,頂端漸細(xì)至鈍,多個(gè)隔膜(圖3-A和圖3-B),大小為(48.5-238.0)μmx(2.7-5.4)岬。從葉片病斑上觀察到的病原菌形態(tài)特征與《中國(guó)真菌志》第二十四卷尾孢菌屬(郭英蘭等,2005)描述的寄生在葫蘆科作物上的瓜類尾孢(Cercospora citrullina)基本一致。

    2.2.3病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 用真菌通用引物ITSl和ITS4對(duì)菌株TBD一2的rDNA-ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,獲得長(zhǎng)度約530 bp的DNA片段(圖4)?;厥赵揇NA片段進(jìn)行測(cè)序,得到538 bp的基因序列(GenBank登錄號(hào)KY824771),將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的基因序列進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析,結(jié)果表明,該序列與瓜類尾孢的同源性達(dá)99%。

    結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,將菌株TBD-2鑒定為瓜類尾孢(C.citrullina)。

    3討論

    國(guó)內(nèi)外已報(bào)道能引起甜瓜葉斑病的病原菌有多種,包括瓜鏈格孢(Alternaria cucumerina)(Egeland Harmon,2007)、交鏈格孢(A.alternata)(Zhouand Everts,2008;Huang et a1.,2011)、多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)(王爽等,2013)和丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)(李亞利等,2007)等真菌和細(xì)菌,由瓜類尾孢(C. citrullina)引起的甜瓜葉斑病未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。瓜類尾孢主要侵染葫蘆科的冬瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆、黃瓜、絲瓜和苦瓜等作物(郭英蘭等,2005),引起葉斑類病害。鑒于能引起甜瓜葉斑病的病原種類較多,為避免混淆,建議將瓜類尾孢引起的甜瓜葉斑病定名為甜瓜尾孢葉斑病。

    本研究發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的組織分離法很難分離到尾孢菌,其原因可能是尾孢菌在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,容易被其他生長(zhǎng)較快的腐生真菌或內(nèi)生真菌覆蓋,因此采用組織分離法通常分離到其他真菌而不是尾孢菌。而采用挑取單孢的分離法,可有效分離到純的尾孢菌,且能減少病菌分離純化的工作量。劉慶奎等(2013)、張小飛等(2014)也是采用單孢分離法對(duì)尾孢屬真菌進(jìn)行分離。

    瓜類尾孢在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,這一特性與其他尾孢屬真菌相同(雷玉明和張建文,2006)。其生長(zhǎng)緩慢的特性將影響后續(xù)的生物學(xué)特性測(cè)定、藥劑敏感性測(cè)定等室內(nèi)試驗(yàn)的開(kāi)展,因此,促進(jìn)該病原菌快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法尚需進(jìn)一步探究。

    4結(jié)論

    結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法,對(duì)近年來(lái)在廣西大棚厚皮甜瓜上嚴(yán)重發(fā)生的一種葉部新病害進(jìn)行鑒定,將病原菌鑒定為瓜類尾孢(C. citrullina),該病是廣西厚皮甜瓜上的一種新病害。

    (責(zé)任編輯 麻小燕)

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