香蕉棒孢霉葉斑病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

番華彩　郭志祥　白亭亭　徐勝濤　楊佩文　尹可鎖　鄭泗軍　潘艷華　李迅東　曾莉

摘要：[目的]明確香蕉棒孢霉葉斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]的生物學(xué)特性，為香蕉棒孢霉葉斑病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。[方法]以采集自云南省香蕉種植區(qū)的香蕉棒孢霉葉斑病病葉片為材料，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌單孢分離，并對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察及致病性測(cè)定；應(yīng)用平板培養(yǎng)法進(jìn)行病原菌生物學(xué)特性測(cè)定。[結(jié)果]香蕉棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；最適碳源為乳糖和甘露醇，最適氮源為蛋白胨；適宜溫度為25-35℃，最適溫度為28℃；病原菌僅能在pH 6-8內(nèi)生長(zhǎng)，最適pH為7；光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定影響，以全黑暗條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)最快。在玉米粉培養(yǎng)基（CMA）上病原菌產(chǎn)孢量最高，光照與黑暗交替有利于產(chǎn)孢。病原菌菌絲致死溫度和時(shí)間為58℃處理15 min，分生孢子的致死溫度和時(shí)間為51℃處理5 min。[結(jié)論]香蕉棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)溫度范圍較寬，偏好高溫，但適應(yīng)的pH較窄；病原菌產(chǎn)孢的關(guān)鍵因子是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和光照條件。

關(guān)鍵詞：香蕉葉斑病；多主棒孢菌；生物學(xué)特性；云南省

中圖分類號(hào)：S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0481-07

0引言

[研究意義]香蕉棒孢霉葉斑病是云南香蕉產(chǎn)區(qū)的主要葉斑病害之一，該病病原菌為多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]（桑利偉，2007），以溫度高、濕度大的7-9月發(fā)生較嚴(yán)重，受害嚴(yán)重的蕉園病葉發(fā)生率在75%以上，且病害有逐年加重的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)。香蕉棒孢霉葉斑病病害癥狀主要表現(xiàn)為：發(fā)病初期，在葉片上形成黃褐色的水浸狀斑點(diǎn)，病斑稍凹陷，后期中央為灰白色的褐色病斑，呈半透明，產(chǎn)生黃色暈圈，葉面上有灰褐色霉層，病斑形狀為橢圓形至圓形，或呈不規(guī)則狀，最后整張葉片干枯、死亡。目前，對(duì)香蕉棒孢霉葉斑病的研究主要集中在病害發(fā)生及病原鑒定等方面，尚缺乏針對(duì)其病原菌生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究。因此，明確香蕉棒孢霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性，對(duì)有針對(duì)性地開(kāi)展病害防治具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]多主棒孢菌最早由魏景超（1982）報(bào)道定名。張賀等（2007）報(bào)道，多主棒孢菌是一個(gè)復(fù)雜的病原菌群體，來(lái)源于不同區(qū)域或同一區(qū)域不同寄主間的多主棒孢菌生物學(xué)特性存在差異。該病原菌侵染范圍較廣，侵染力強(qiáng)，能侵染70多種作物（關(guān)國(guó)經(jīng)等，2000；李明遠(yuǎn)等，2001；鄒慶道等，2002；張賀等，2007；張麗麗等，2008；羅霓等，2009；陳旭玉等，2012），引起葉斑、莖稈、果實(shí)腐爛等病害癥狀。Blazaquez于1969年報(bào)道該病原菌在香蕉上發(fā)生危害；桑利偉（2007）對(duì)海南島的香蕉真菌病害進(jìn)行調(diào)查與鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，在海南島有香蕉棒孢霉葉斑病發(fā)生；林善海等（2011）報(bào)道在廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)有香蕉棒孢霉葉斑病發(fā)生，并對(duì)香蕉棒孢霉葉斑病菌進(jìn)行了分離鑒定。[本研究切入點(diǎn)]目前，關(guān)于香蕉棒孢霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]在對(duì)云南省香蕉棒孢霉葉斑病病原菌進(jìn)行單孢分離、形態(tài)特征觀察及致病性測(cè)定的基礎(chǔ)上，研究在不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH和光照條件下病原菌的生物學(xué)特性，旨在為香蕉棒孢霉葉斑病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)樣采集及病原菌菌株分離

從云南省香蕉種植區(qū)西雙版納州打洛縣采集發(fā)病巴西蕉葉片，取病斑病健交界處組織作為分離材料，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌（方中達(dá)，2001），置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，28℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)2 d，純化菌絲2次，待菌絲產(chǎn)孢后用單孢分離法挑取單孢至PDA斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存，供鑒定和生物學(xué)特性測(cè)定。

1.2病原菌形態(tài)特征觀察

單孢菌株轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上于28℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌菌落形狀、顏色、菌絲疏密程度等。培養(yǎng)15 d后，光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)特征，并測(cè)量計(jì)算分生孢子大小。

1.3病原菌致病性測(cè)定

采用針刺接種法，將病原菌菌絲塊接種于溫室內(nèi)種植的健康巴西蕉葉片（接種7-8張葉片）上，以純PDA培養(yǎng)基接種為對(duì)照，重復(fù)4次。接種葉片先用70%酒精進(jìn)行表面消毒，然后用滅菌大頭針將接種部位刺傷，再把PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的病原菌菌餅（直徑為5 mm）接種于刺傷部位，用滅菌濕棉球保濕接種部位48 h，定期觀察病害發(fā)生情況，發(fā)病后，取病健交界處葉片組織分離病原菌，對(duì)分離獲得的病原菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察。

1.4病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1不同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 參照劉秀娟等（1996）、方中達(dá)（2001）的方法配制黑麥瓊脂培養(yǎng)基（MAS）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）、PDA培養(yǎng)基、玉米瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（cA）和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）等6種供試培養(yǎng)基。接種方法：病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用直徑為5mm的滅菌打孔器打取菌齡大小一致的菌絲塊，菌絲塊面向下接種于備用的6種培養(yǎng)基中間，每處理重復(fù)4次。置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7和1 5 d后，分別用十字交叉法測(cè)量計(jì)算菌落大小，顯微鏡檢測(cè)10×10倍下的孢子數(shù)，每處理檢測(cè)10個(gè)顯微鏡視野，每處理重復(fù)4次。

1.4.2不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 參照肖仲久和李小霞（2013）的方法，測(cè)定病原菌菌絲在5、10、15、20、25、28、30、35和40℃等9個(gè)溫度下的生長(zhǎng)情況，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.3不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 采用PDA培養(yǎng)基，測(cè)定病原菌菌絲在培養(yǎng)基pH 5、6、7、8、9和10等6個(gè)梯度（PDA培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60℃左右時(shí)，用1 mol/L 0.1%NaOH和HCl溶液調(diào)配滅菌培養(yǎng)基pH）下的生長(zhǎng)情況（唐爽爽等，2014），每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.4不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以剔除碳源后的查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制成含蔗糖、D一麥芽糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖等5種碳源的固體培養(yǎng)基，對(duì)照為不加碳源查氏培養(yǎng)基。測(cè)定不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.5不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以剔除氮源后的查氏（czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制成含蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鈉、磷酸氫二銨和脲等5種氮源的固體培養(yǎng)基，對(duì)照為不加氮源查氏培養(yǎng)基。測(cè)定不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.6不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 設(shè)24 h黑暗、24 h光照和12 h黑暗+12 h光照交替等3種光照條件處理，測(cè)定不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.7病原菌菌絲致死溫度和時(shí)間測(cè)定 綜合參照張賀等（2007）、孫志峰等（2008）、楊永利等（2015）的方法，病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，無(wú)菌環(huán)境下分別用100 mL無(wú)菌水將每個(gè)培養(yǎng)基中的菌絲制成菌懸液，各取10 mL菌懸液裝入滅菌試管并塞上試管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒溫水浴鍋中分別水浴處理5、10和15 min，水浴過(guò)程中緩慢搖動(dòng)試管。處理結(jié)束后降至室溫，用移液槍取0.2 mL不同處理的菌懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，于28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h后，觀察培養(yǎng)基上有無(wú)菌落生長(zhǎng)，以未經(jīng)過(guò)溫度處理的菌懸液為對(duì)照，每處理重復(fù)4次。

1.4.8病原菌分生孢子致死溫度和時(shí)間測(cè)定 病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，于10×10倍顯微鏡下配制濃度為每個(gè)視野10～15個(gè)孢子的懸浮液，取10 mL分生孢子懸浮液裝入滅菌試管并塞上試管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒溫水浴鍋中分別處理5、10和15 min，水浴過(guò)程中緩慢搖動(dòng)試管，浴后立即取出降至室溫（張賀等，2007；孫志峰等，2008；楊永利等，2015），用移液槍取0.2 mL不同處理的菌懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，于28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h后，觀察培養(yǎng)基上有無(wú)菌落生長(zhǎng)，以未經(jīng)過(guò)溫度處理的孢子懸浮液為對(duì)照，每處理重復(fù)4次。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌形態(tài)特征描述

在PDA培養(yǎng)基上，病原菌菌落疏展，灰色至灰褐色，呈毛發(fā)狀或細(xì)絨毛狀，氣生菌絲茂盛，菌落中央顏色較邊緣深并隆起（圖1-A），菌落背面中央呈黑褐色（圖1-B）。分生孢子梗單生或數(shù)根叢生，直立或彎曲，不分枝，褐色，光滑，具1-7個(gè)隔膜。菌絲有分隔，淺褐色，有隔膜。分生孢子頂生、單生，淺褐色，棍棒狀至圓筒形，直或稍彎，頂端漸尖細(xì)，基部平切具孢臍，大?。?0-220）gmx（10-20）um（圖1-C）。結(jié)合其菌落特征及戚佩坤（2000）、林善海等（2011）關(guān)于該菌的特征描述，鑒定該菌為多主棒孢菌[C. cas-siicola（Berk&Curt）Wei]。

2.2病原菌致病性測(cè)定結(jié)果

接種病原菌3 d后開(kāi)始巴西蕉葉片表現(xiàn)發(fā)病癥狀，接種部位呈黃褐色水浸狀斑點(diǎn)，后期逐漸擴(kuò)展成圓形至橢圓形褐色病斑，周?chē)悬S色暈圈，中央灰白色、半透明，后期病部可見(jiàn)灰黑色霉層（圖2-A）。接種病原菌后的表現(xiàn)癥狀與大田自然發(fā)生癥狀（圖2-B）相似，并從接種發(fā)病病斑組織病健交界處能再次分離到與供試病原菌菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)一致的菌株，對(duì)照葉片無(wú)發(fā)病癥狀。

2.3病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.3.1不同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖3可知，病原菌在供試6種培養(yǎng)基上均能較好地生長(zhǎng)，其中最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其次是MAS培養(yǎng)基，二者的菌落直徑顯著大于其他培養(yǎng)基上的菌落直徑（P<0.05，下同），隨后是OA和PSA培養(yǎng)基，但在OA培養(yǎng)基上病原菌菌絲稀疏、顏色淺，在CMA和CA培養(yǎng)基上病原菌生長(zhǎng)速度稍慢。培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢量影響亦較大，其中產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基，其產(chǎn)孢量顯著多于其他培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，其次為CA培養(yǎng)基，在OA、MAS、PSA和PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢均較少。

2.3.2不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有顯著影響，10～40℃下病原菌均能長(zhǎng)出菌絲，但生長(zhǎng)差異明顯，25～35℃時(shí)病原菌菌絲生長(zhǎng)良好，其中在28℃下菌落直徑最大，顯著大于其他溫度（30℃除外）條件下的菌落直徑，28℃為菌絲的最適生長(zhǎng)溫度。

2.3.3不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響較大，菌絲僅在pH 6～8能生長(zhǎng)，最適為pH 7。

2.3.4不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，病原菌菌絲在乳糖和甘露醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，二者的菌落直徑顯著大于其他碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑，其次為D一麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，在無(wú)碳源的培養(yǎng)基上病原菌雖然可以生長(zhǎng)，但菌絲較稀疏、顏色較淺。

2.3.5不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，病原菌菌絲在蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其菌落直徑顯著大于其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑，其次為酵母浸粉、磷酸氫二銨和硝酸鈉，在無(wú)氮源的培養(yǎng)基上病原菌雖然可以生長(zhǎng)，但菌絲較稀疏、顏色較淺。

2.3.6不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 3種光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有一定影響，以全黑暗條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)最快，其菌落直徑顯著大于其他2種光照條件下的菌落直徑；全光照和12 h光暗交替處理對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響不明顯。不同光照處理對(duì)病原菌產(chǎn)孢有顯著影響，12 h黑暗+12 h光照交替條件下有利于病原菌產(chǎn)孢，在此光照條件下的產(chǎn)孢量顯著多于其他2種光照條件下的產(chǎn)孢量，全黑暗和全光照條件下的產(chǎn)孢量較少。

2.3.7病原菌菌絲的致死溫度和時(shí)間 病原菌菌絲在7個(gè)不同溫度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分別處理5、10和15 min后，發(fā)現(xiàn)40～55℃各處理的病原菌菌絲均能生長(zhǎng)，60～70℃各處理的病原菌菌絲均不能生長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)56、57、58和59℃等4個(gè)溫度下分別處理5、10和15 min后，56和57℃各處理的病原菌菌絲均能生長(zhǎng)，58℃處理15 min及59℃各處理的病原菌菌絲均不能生長(zhǎng)，表明病原菌菌絲的致死溫度和時(shí)間為58℃處理15 min。

2.3.8病原菌分生孢子的致死溫度和時(shí)間 病原菌分生孢子懸浮液在7個(gè)不同溫度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分別處理5、10和15 min）～，發(fā)現(xiàn)40～50℃各處理的病原菌分生孢子懸浮液在PDA培養(yǎng)基上均能形成新的菌落，55～70℃各處理的病原菌分生孢子懸浮液在PDA培養(yǎng)基上均不能形成新的菌落；經(jīng)過(guò)51、52、53和54℃等4個(gè)溫度下分別處理5、10和15 min后，各處理在PDA培養(yǎng)基上均不能形成新的菌落，表明病原菌分生孢子的致死溫度和時(shí)間為51℃處理5 min。

3討論

本研究中，香蕉多主棒孢菌菌絲在10～40℃均能生長(zhǎng)，適宜溫度為25～35℃，最適溫度為28℃，與云南香蕉棒孢霉葉斑病于7～9月溫度高、濕度大的季節(jié)集中發(fā)生流行的規(guī)律一致。與黃瓜（劉鳴滔，2005；吳橋，2017）、橡膠樹(shù)（張賀等，2007；張春霞等，2010）、番木瓜（羅霓等，2009）、廣藿香（陳旭玉等，2012）、甜瓜（王爽等，2013）和蔬菜（楊苗，2013）等來(lái)源不同或相同地區(qū)的不同寄主的多主棒孢菌相比，香蕉多主棒孢菌適應(yīng)生長(zhǎng)的溫度范圍廣，適宜生長(zhǎng)的溫度高，與楊苗（2013）發(fā)現(xiàn)的多主棒孢菌對(duì)不同溫度的敏感性與寄主來(lái)源密切相關(guān)、與地理來(lái)源不相關(guān)的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，病原菌菌絲的致死溫度和時(shí)間為58℃處理15 min，分生孢子的致死溫度和時(shí)間為51℃處理5 min，與張賀等（2007）報(bào)道的橡膠多主棒孢菌菌絲致死溫度和時(shí)間為60℃處理15 min，分生孢子致死溫度和時(shí)間為55℃處理5 min，以及關(guān)國(guó)經(jīng)等（2006）報(bào)道的烤煙多主棒孢菌分生孢子致死溫度和時(shí)間為55℃處理10 min均有差異，可能與不同的寄主及來(lái)源有關(guān)。

在3種光照條件下香蕉多主棒孢菌菌絲生長(zhǎng)均良好，全黑暗條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)最快，全光照和12 h光暗交替處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，12 h光暗交替有利于病原菌產(chǎn)孢，說(shuō)明該病原菌產(chǎn)孢量對(duì)光照敏感，與鄒慶道等（2002）、張賀等（2007）的報(bào)道一致，但與羅霓等（2009）、陳旭玉等（2012）的研究結(jié)果存在差異。

香蕉多主棒孢菌對(duì)pH較敏感，菌絲僅在接近中性（pH 6-8）的條件下生長(zhǎng)，最適pH為7。而黃瓜（劉鳴滔，2005）、橡膠樹(shù)（張賀等，2007；張春霞等，2010）、番木瓜（羅霓等，2009）和廣藿香（陳旭玉等，2012）的多主棒孢菌對(duì)pH適應(yīng)范圍較廣，在pH 3-11范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。本研究中的多主棒孢菌系首次分離自云南蕉園中，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，香蕉棒孢霉葉斑病病原菌與不同寄主作物來(lái)源的多主棒孢菌菌株問(wèn)的生物學(xué)特性存在明顯差異，可能與菌株遺傳或生理性差異等有關(guān)，具體原因需對(duì)病原菌開(kāi)展進(jìn)一步研究。香蕉棒孢霉葉斑病是云南香蕉產(chǎn)區(qū)的主要葉斑病之一，對(duì)云南香蕉產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病害的防控研究，以控制其發(fā)生危害。

4結(jié)論

香蕉棒孢霉葉斑病病原菌與不同寄主作物來(lái)源的多主棒孢菌菌株間的生物學(xué)特性存在明顯差異，該病原菌菌絲生長(zhǎng)溫度范圍較寬，偏好高溫，但適應(yīng)的pH較窄，病原菌菌絲僅在接近中性的條件下生長(zhǎng)；病原菌產(chǎn)孢的關(guān)鍵因子是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和光照條件。

（責(zé)任編輯 麻小燕）