不同氮素來源對(duì)烤煙上部葉碳氮代謝及其基因表達(dá)的影響

黃化剛　申燕　吳飛躍　楊振智　劉世碧　喻奇?zhèn)ァ≠Z宏防

摘要：[目的]研究不同氮素來源（有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥）對(duì)烤煙上部煙葉碳氮代謝及關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步調(diào)控肥料施用、提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。[方法]在保證用氮量一致的基礎(chǔ)上，設(shè)無機(jī)氮肥和有機(jī)氮肥兩個(gè)處理，煙苗移栽后60、70、80～190 d各采樣1次，觀察不同處理的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，測(cè)定煙葉的總糖、總氮和煙堿含量，并對(duì)比分析影響碳氮代謝的關(guān)鍵基因表達(dá)。[結(jié)果]隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)氮肥處理上部煙葉細(xì)胞中的淀粉顆粒增多，嗜鋨顆粒含量增加且體積增大。兩種氮肥處理成熟期上部煙葉總糖含量均呈先降低再升高的變化趨勢(shì)，其中有機(jī)氮肥處理上部煙葉的總糖含量相對(duì)較高；兩處理上部煙葉總氮含量隨著生育期的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，有機(jī)氮肥處理在成熟前期顯著低于無機(jī)氮肥處理（P<0.05，下同），但移栽后90 d二者趨于一致；兩處理上部煙葉煙堿含量在成熟期呈上升趨勢(shì)，有機(jī)氮肥處理的煙堿含量除移栽后80 d顯著較低外，其他取樣時(shí)期均高于無機(jī)氮肥處理。碳代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，蔗糖合成酶基因（SuSI）、淀粉合成酶基因（SSI）、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）、支鏈淀粉合成酶基因（SBEI）和α-淀粉酶基因（AMML）在成熟后期（移栽后90 d）高表達(dá)是導(dǎo)致上部煙葉總糖積累較多的主要原因。氮代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NRTI）和鳥氨酸脫羧酶基因（ODC）在有機(jī)氮源條件下高表達(dá)是導(dǎo)致上部煙葉煙堿含量顯著升高的主要原因。[結(jié)論]施用有機(jī)氮肥有利于成熟期上部煙葉碳氮代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而促進(jìn)上部煙葉總糖和煙堿含量增加，同時(shí)降低總氮含量。

關(guān)鍵詞：烤煙；有機(jī)氮肥；無機(jī)氮肥；上部葉；碳氮代謝；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0462-07

0引言

[研究意義]碳氮代謝是煙草的最基本代謝之一（黃樹永和陳良存，2005）。碳氮代謝易受土壤、肥料等因素影響（劉衛(wèi)群等，1998；母少東等，2014），尤其受植煙土壤中的氮素影響顯著（李春儉等，2007）。植煙土壤中的氮素主要以無機(jī)硝態(tài)和銨態(tài)氮被植物根系細(xì)胞膜上的氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用，即不同氮素來源與烤煙碳氮代謝的協(xié)調(diào)程度關(guān)系密切（張新要等，2005），而碳氮代謝協(xié)調(diào)程度及動(dòng)態(tài)變化又決定著煙葉化學(xué)成分比例，與煙葉品質(zhì)關(guān)系緊密?？緹熒喜繜熑~是產(chǎn)量核心，但在大田生長(zhǎng)過程中存在含氮化合物含量偏高、含碳化合物含量偏低等問題，造成煙葉內(nèi)部化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致上部煙葉品質(zhì)降低（劉芳等，2005；許自成等，2005）。因此，研究不同氮素來源對(duì)烤煙上部葉碳氮代謝及其基因表達(dá)的影響，對(duì)提高上部煙葉品質(zhì)具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)受煙葉碳氮代謝動(dòng)態(tài)平衡的影響，不同肥料的施用對(duì)煙葉碳氮代謝動(dòng)態(tài)平衡影響明顯。樊武廣等（2012）研究表明，硝酸銨和芝麻餅肥配施作為氮源，煙株的淀粉酶活性及硝酸還原酶等活性較協(xié)調(diào)，有利于優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)。劉維智等（2014）分析了氮素及其形態(tài)對(duì)煙草碳代謝的影響，結(jié)果表明煙草對(duì)氮素的吸收能影響其自身的糖代謝過程。王晶等（2016）研究表明，增施生物炭會(huì)對(duì)煙株的化學(xué)成分和香氣物質(zhì)產(chǎn)生影響，撫州煙區(qū)以300 kg/ha施炭量處理煙株的化學(xué)成分更協(xié)調(diào)。楊勝男等（2016）提出施用復(fù)合有機(jī)肥可改變煙葉直鏈和支鏈淀粉的比例，促進(jìn)淀粉積累。張弘等（2016）研究表明，有機(jī)物料的施用能改善植煙土壤養(yǎng)分，添加生物炭可顯著增加土壤碳氮代謝相關(guān)酶活性，進(jìn)而提高煙株的碳氮代謝，改善煙葉品質(zhì)。張嘉煒等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，添加生物炭對(duì)烤煙碳氮代謝平衡影響明顯，進(jìn)而影響烤煙總糖、總氮等碳氮化合物含量。牛德新等（2017）提出，烤煙成熟期中部煙葉碳氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量受氮肥施用量影響明顯，進(jìn)而影響烤煙的碳氮代謝平衡。[本研究切入點(diǎn)]目前，關(guān)于不同氮素來源尤其是酒糟有機(jī)肥對(duì)成熟期烤煙上部葉碳氮代謝及基因表達(dá)影響的研究鮮有報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]通過對(duì)煙株施用不同肥料（無機(jī)氮肥和有機(jī)氮肥），從烤煙上部葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、總糖、總氮、煙堿及相關(guān)基因表達(dá)分析等方面人手，系統(tǒng)研究不同氮素來源對(duì)烤煙上部葉碳氮代謝及基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步調(diào)控肥料施用、提高上部煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為云煙87。

供試肥料中有機(jī)氮肥為金沙酒糟有機(jī)肥，購自貴州市金沙縣加孟農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社，總養(yǎng)分6.98%，水含量29.00%，有機(jī)質(zhì)含量74.80%，含氮量3.50%；無機(jī)氮肥購自貴州畢節(jié)靈豐復(fù)肥有限公司，其養(yǎng)分配比為N：P：K=10：10：25。

1.2試驗(yàn)方法

在貴州省畢節(jié)市金沙縣開化科技園（東經(jīng)106。1133.26”、北緯27。2956.56”）進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)田土地開闊、平坦、向陽，土壤類型一致，土壤理化性狀：堿解氮159.27 mg/kg、速效磷25.36 mg/kg、速效鉀308.22 mg/kg、有機(jī)質(zhì)23.7 g/kg，土壤pH 6.36。

試驗(yàn)設(shè)有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥2個(gè)處理，其中無機(jī)氮肥處理按照當(dāng)?shù)刈罴咽┓史绞竭M(jìn)行，施用復(fù)合肥（N：P：K=10：10：25）1050kg/ha；有機(jī)氮肥處理參照當(dāng)?shù)赜袡C(jī)煙施肥方式，施用有機(jī)肥3000 kg/ha（含N 3.5%），另施用硫酸鉀鎂和鈣鎂磷肥各225 kg/ha，以保證與無機(jī)施肥處理的鉀、磷用量一致。無機(jī)氮肥和有機(jī)氮肥處理均施用一次基肥，不再進(jìn)行追肥。

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)面積約330m²，3次重復(fù)，共6個(gè)小區(qū)。采用漂浮育苗方法育苗，成熟期取樣4次，即煙苗移栽后60、70、80和90 d各取一次樣。取樣時(shí)隨機(jī)選5株長(zhǎng)勢(shì)基本相同的煙株，混合選取上部葉片，田間操作時(shí)樣品快速放人液氮，并在超低溫冰箱中保存。每處理3次重復(fù)?？竞鬅熑~樣品選取等級(jí)為B3F的煙葉。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 選取成熟期的上部葉片，用刀片交叉切割葉片大小為1-3mm，將切下的葉片放入5%戊二醛溶液（磷酸緩沖液、25%戊二醛溶液和雙蒸水）中固定，并置于冰箱內(nèi)4℃保存，為防止氧化，每隔一周換一次溶液。采用透射電鏡觀察淀粉粒超微結(jié)構(gòu)。

1.3.2總糖、總氮和煙堿含量測(cè)定 取成熟期的上部煙葉，105℃殺青15 min，然后60℃烘干至恒重，處理約12 h。采用德國SEAL AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定總糖（YC/T 159-2002）、總氮（YC/T 161-2002）及煙堿（YC/T 160-2002）含量。

1.3.3基因表達(dá)分析 選取成熟期5株相同部位、發(fā)育基本一致的上部葉，混合取樣，快速放人液氮中冷凍保存。采用Trizol法提取煙草葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank發(fā)布的碳代謝途徑基因（表1）：淀粉合成酶關(guān)鍵基因（SS1）、支鏈淀粉合成酶關(guān)鍵基因（SBEI）、α-淀粉酶關(guān)鍵基因（AMML）、蔗糖合成酶關(guān)鍵基因（SuS1）、焦磷酸化酶關(guān)鍵基因（AGPase）、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）；氮代謝基因（表2）：硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NRTI）、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（PMT）、鳥氨酸脫羧酶基因（ODC）、喹啉酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因（QPT），依據(jù)以上基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以L25為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用Sigmplot 12.5和SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥條件下烤煙成熟期上部煙葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

為探明不同氮素來源對(duì)烤煙成熟期上部葉葉片細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)的影響，通過電鏡試驗(yàn)對(duì)葉片發(fā)育結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖1所示，在移栽后70 d時(shí)，兩種氮素條件下葉片細(xì)胞柵欄組織中葉綠體及其他細(xì)胞器均靠近細(xì)胞壁分布，與無機(jī)氮肥處理相比，有機(jī)氮肥處理的上部煙葉液泡膜及葉綠體的被膜間附著高電子密度的物質(zhì)有所增多，葉綠體所含的淀粉粒和嗜鋨顆粒含量多，但體積相對(duì)較小。在移栽后90 d時(shí)，有機(jī)氮肥處理上部煙葉細(xì)胞的液泡膜及葉綠體被膜間附著的高電子密度物質(zhì)較多，葉綠體淀粉粒也較多，嗜鋨顆粒含量多且體積大。

2.2有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥條件下烤煙成熟期上部煙葉總糖含量變化規(guī)律

由圖2可看出，不同氮肥處理成熟期上部煙葉總糖含量均呈先降低再升高的變化趨勢(shì)，二者均在移栽后70 d時(shí)達(dá)最低值。與無機(jī)氮肥處理相比，有機(jī)氮肥處理上部煙葉在成熟期的總糖含量整體較高，移栽后60和90 d時(shí)兩處理差異達(dá)顯著水平（P<0.05，下同）。

2.3有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥條件下烤煙成熟期上部煙葉總氮含量變化規(guī)律

由圖3可看出，有機(jī)氮肥處理上部煙葉總氮含量在成熟前、中期（移栽后60～80 d）呈逐漸降低趨勢(shì)，成熟后期（移栽后80～90 d）又有所回升；無機(jī)氮肥處理上部煙葉總氮含量在整個(gè)成熟期呈下降趨勢(shì)，但與有機(jī)氮肥處理相比，其總氮含量整體較高，在移栽后60～80 d時(shí)二者差異均達(dá)顯著水平。

2.4有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥條件下烤煙成熟期上部煙葉煙堿含量變化規(guī)律

由圖4可看出，兩種氮肥處理上部煙葉煙堿含量在成熟期整體上呈上升趨勢(shì)。除移栽后80 d有機(jī)氮處理上部煙葉煙堿含量顯著低于無機(jī)氮肥處理外，其他取樣時(shí)期有機(jī)氮肥處理上部煙葉煙堿含量均高于無機(jī)氮處理，其中在移栽后70和90 d時(shí)二者差異顯著。

2.5有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥條件下烤煙成熟期上部煙葉碳氮代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)分析

2.5.1碳代謝關(guān)鍵基因表達(dá)分析 對(duì)上部煙葉碳代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示，SuS1和SS1基因在兩種施肥條件下的表達(dá)模式基本一致，表現(xiàn)為成熟后期（移栽后90 d）有機(jī)氮肥處理上部煙葉中的表達(dá)量高于無機(jī)氮肥處理；AGPase基因在兩種施肥處理下均在移栽后70 d時(shí)達(dá)最大值，有機(jī)氮肥處理上部煙葉中的表達(dá)量顯著高于無機(jī)氮肥處理；有機(jī)氮肥處理上部煙葉中GBSSI、SBE1和AMML基因的表達(dá)量在成熟后期（移栽后90 d）均顯著高于無機(jī)氮肥處理。整體來看，除AGPase基因外，成熟后期有機(jī)氮肥處理煙葉碳代謝途徑關(guān)鍵基因在上部煙葉中的表達(dá)量均顯著高于無機(jī)氮肥處理。

2.5.2氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)分析 對(duì)上部煙葉氮素代謝途徑關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，結(jié)果（圖6）顯示，煙葉成熟期NRTl基因在兩種施肥條件下均強(qiáng)烈表達(dá)，其中有機(jī)氮肥處理在移栽后90 d表達(dá)量最高，而無機(jī)氮肥處理在移栽后70 d表達(dá)量最高，表明有機(jī)氮肥處理下煙株在成熟后期具有較高的氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力；PMT基因是合成煙堿的一個(gè)最關(guān)鍵基因，該基因在葉片中未檢測(cè)到表達(dá)，與煙堿是在根部合成的結(jié)果相一致；QPT基因在兩種施肥處理的上部煙葉中均有表達(dá)，其中移栽后90 d時(shí)在有機(jī)氮肥處理上部煙葉中的表達(dá)量略高于無機(jī)氮肥處理；ODC基因表達(dá)量和NRT1基因表達(dá)量趨勢(shì)相一致，說明硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)與煙堿合成呈正相關(guān)。整體分析氮代謝途徑基因的表達(dá)情況，表明有機(jī)氮肥處理上部煙葉在成熟后期仍維持較高的氮代謝水平。

3討論

碳氮代謝是烤煙最基本的代謝途徑（岳紅賓，2007），烤煙碳氮代謝途徑易受到海拔高度、光照等生態(tài)環(huán)境因素的影響，此外土壤的供氮量及供氮方式對(duì)烤煙碳氮平衡也有一定影響（史宏志等，1999；黃國文和陳良碧，2004；習(xí)向銀等，2008；楊永霞等，2012）。本研究立足于不同氮素來源（有機(jī)氮肥和無機(jī)氮肥）對(duì)烤煙碳氮代謝的影響，對(duì)煙葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、總糖、總氮、煙堿及相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為提高上部煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

本研究對(duì)烤煙成熟期上部煙葉的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，上部葉在成熟后期（移栽后90 d）其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)嗜鋨顆粒較多且淀粉顆粒多，說明后期淀粉降解比較充分，與總糖含量后期升高的結(jié)果相一致。進(jìn)一步的基因表達(dá)分析結(jié)果表明，除AGPase基因外，有機(jī)氮肥處理上部煙葉的碳代謝途徑關(guān)鍵基因SuS1、GBSSI、SS1、SBE1和AMML在成熟后期的表達(dá)量均高于無機(jī)氮肥處理，碳代謝途徑關(guān)鍵基因高表達(dá)是導(dǎo)致上部煙葉糖積累較多的主要原因，與賈宏昉等（2014）研究得出的增施腐熟秸稈可提高烤煙碳代謝相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果相似。

氮素與煙堿合成密不可分（李進(jìn)平等，2010）。本研究對(duì)上部煙葉氮代謝途徑進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮肥處理上部煙葉總氮含量在移栽后60～80 d顯著低于無機(jī)氮肥處理，整體上呈下降趨勢(shì)，而煙堿含量整體上呈上升趨勢(shì)。與無機(jī)氮肥處理相比，總氮含量在移栽后90 d略低但差異不明顯，煙堿含量在移栽后80-90 d呈線性上升且移栽后90 d顯著較高。進(jìn)一步的氮代謝途徑關(guān)鍵基因分析結(jié)果表明，有機(jī)氮肥處理上部煙葉的NRT1和ODC基因在成熟后期時(shí)表達(dá)量顯著高于無機(jī)氮肥處理，這兩個(gè)基因高表達(dá)是有機(jī)氮肥條件下上部煙葉煙堿含量增加的主要原因，因此推測(cè)NRT1基因與煙堿的合成也呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，有機(jī)氮肥處理下上部煙葉在成熟后期具有較高的氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力。但有機(jī)氮肥對(duì)上部煙葉碳氮代謝的影響是否是通過活化土壤養(yǎng)分，進(jìn)而影響相應(yīng)的酶活性（關(guān)鍵酶基因表達(dá)增強(qiáng)），還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

不同氮素來源對(duì)烤煙上部煙葉碳氮代謝影響明顯，其中施用有機(jī)氮肥有利于成熟期上部煙葉碳氮代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而促進(jìn)上部煙葉總糖和煙堿含量增加，同時(shí)降低總氮含量。

（責(zé)任編輯 王暉）