東北鐵線蓮不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

田淑霞　李長艷　張婧嫻

摘要目的：研究和比較東北鐵線蓮不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性。方法：東北鐵線蓮經(jīng)提取、萃取、濃縮得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，實驗分為陰性對照組、陽性對照組和實驗組，分別利用小鼠醋酸扭體疼痛模型和脂多糖誘導RAW2647細胞炎性反應模型評估4個提取部位的鎮(zhèn)痛活性和抗炎活性。結果：在鎮(zhèn)痛實驗中，乙酸乙酯部位對小鼠扭體的抑制率最高；抗炎實驗結果顯示，乙酸乙酯部位抑制NO的效果最為顯著。結論：東北鐵線蓮不同部位的抗炎鎮(zhèn)痛效果不同，其中乙酸乙酯部位抗炎鎮(zhèn)痛活性最強。

關鍵詞東北鐵線蓮；提取部位；抗炎；鎮(zhèn)痛

Study on Antiinflammatory and Analgesic Effect of Different Fractions Extracted from Clematis manshurica Rupr

Tian Shuxia1，2，Li Changyan1，Zhang Jingxian1，Xiao Xiao3，Guo Cheng1，Du Jiang2，Han Yonglong1，3

（1 Department of Pharmacy，Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People′s Hospital，Shanghai 200233，China； 2 Guiyang University of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China； 3 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

AbstractObjective：To study the antiinflammatory and analgesic activities of different fractions extracted from Clematis manshurica Rupr.Methods：The parts of petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and nbutanol were obtained by abstracting，extracting and concentrating.The experiment was divided into three groups：negative control group，positive control group and experimental group.In the study，mouse acetic acid writhing and lipopolysaccharide （LPS） induced RAW2647 cell model were used to evaluate analgesic and antiinflammatory activity of the four fractions.Results：In the experiment of analgesic，the inhibition rate of writhing was the most significant in the ethyl acetate fraction.The results of antiinflammatory experiment suggested that the ethyl acetate fraction showed significant inhibitory effect on nitric oxide （NO）.Conclusion：The antiinflammatory and analgesic effects of different parts of Clematis mandshurica were different，and ethyl acetate fraction showed the most significant antiinflammatory and analgesic activity.

Key WordsClematis manshurica Rupr； Extract； Antiinflammation； Analgesia

中圖分類號：R2855文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.047

東北鐵線蓮（Clematis manshurica Rupr）是毛茛科鐵線蓮屬植物，其根及根莖可作為中藥威靈仙入藥，具有通絡止痛、祛風濕之功效，在臨床上主要用于風濕痹痛，肢體麻木，筋脈拘攣，屈伸不利等癥。隨著現(xiàn)代藥理學和臨床醫(yī)學研究的不斷深入，東北鐵線蓮更是顯示出抗腫瘤、解痙、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等諸多藥理活性[1]。研究[23]發(fā)現(xiàn)，東北鐵線蓮的醇提取物和根部提取物可以通過抑制LPS/IFNγ誘導的巨噬細胞中NO和PGE2的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。劉光耀等[4]以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW2647細胞為炎性反應模型研究威靈仙不同提取部位的抗炎作用，結果顯示活性強弱依次為威靈仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位。但是東北鐵線蓮中各提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用是否有差異及對巨噬細胞分泌炎性反應因子的干預作用研究鮮有文獻報道。本研究采用小鼠醋酸扭體疼痛模型和LPS誘導RAW2647細胞炎性反應模型分別研究東北鐵線蓮不同提取部位的鎮(zhèn)痛和抗炎作用，明確東北鐵線蓮抗炎鎮(zhèn)痛的活性部位，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11材料

111動物與細胞無特定病原體（SPF）級健康ICR小鼠320只，雌雄各半，體重20～25 g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）20130016；實驗動物合格證號2008001663805]，在上海市第六人民醫(yī)院實驗動物中心[動物使用許可證號：SYXK（滬）20160020]適應性飼養(yǎng)3 d，動物自由攝水，室溫控制在23～25 ℃，相對濕度為50%～70%，每天光照10 h～12 h。RAW2647細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

112藥物東北鐵線蓮購于上海虹橋中藥飲片有限公司（批號：160307），經(jīng)鑒定為毛莨科鐵線蓮屬東北鐵線蓮（Clematis manshurica Rupr）的干燥根莖；冰醋酸（批號：20160308，臺山市新寧制藥有限公司）；阿司匹林腸溶片（批號：BJ28761，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）。

113試劑與儀器DMEM（Dulbecco minimum essential medium）培養(yǎng)基（批號：319006013，維森特生物科技有限公司）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（批號：171860，Biosharp公司）；胎牛血清（FBS）（批號：20170710，杭州四季青生物工程材料有限公司）；脂多糖（LPS）（批號：017M4112V，Sigma公司）；MTT（批號：303H0528，索萊寶Solarbio公司）；NO檢測試劑盒（批號：20170919，南京建成生物工程研究所有限公司）。二甲苯（分析純），上海江萊生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO，分析純），國藥集團化學試劑有限公司；其他化學試劑乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等均為分析純，購于上海凌峰化學試劑有限公司。N1100D型旋轉蒸發(fā)器（上海愛朗儀器有限公司）；SB2000型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG9147A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SL2001N型電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；CKX31SF型倒置顯微鏡（Olympus公司）；SIMPLICITY型超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；微量加樣器（Eppendorf公司）；TDL802B型低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；ALLEGRAX22R型高速離心機（Beckman公司）；SWCJ2FD型潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；Epoch型酶標儀（BioTek公司）。

12方法

121東北鐵線蓮提取取48 kg東北鐵線蓮用75%乙醇料液比1∶10浸泡16 h，80 ℃提取1次，3 h；再用75%乙醇料液比1∶8，80 ℃提取2次，每次2 h。合并3次提取液，過濾濃縮至31L。濃縮液去沉淀后，用石油醚1∶1萃取3次，合并石油醚層；水層用氯仿1∶1萃取3次，合并氯仿層；水層用乙酸乙酯1∶1萃取3次，合并乙酸乙酯層；水層用正丁醇1∶1萃取3次，合并正丁醇層。4種萃取液分別濃縮至干，得到東北鐵線蓮石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位。

122動物分組與給藥方法

1221藥液及工作液的配制陰性對照組藥液：05%CMCNa；陽性對照組藥液：用05%CMCNa配制阿司匹林至終濃度20 mg/mL；實驗工作液：用05%CMCNa配制石油醚部位02 mg/mL、04 mg/mL、08 mg/mL，氯仿部位055 mg/mL、11 mg/mL、22 mg/mL，乙酸乙酯部位175 mg/mL、35 mg/mL、7 mg/mL，正丁醇部位8 mg/mL、16 mg/mL、32 mg/mL。

1222小鼠醋酸扭體實驗采用小鼠醋酸扭體模型篩選威靈仙中具有鎮(zhèn)痛活性的有效部位。將小鼠分為模型組、陽性對照組和給藥組（4種浸膏），且給藥組分別設高、中、低劑量組，每組10只，給藥1周后，小鼠腹腔注射12%醋酸溶液02 mL/10 g，記錄每只小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)，計算扭體抑制率。并將4個部位低中高劑量對小鼠扭體抑制率制圖，比較其鎮(zhèn)痛活性強弱。

扭體抑制率（%）=（陰性對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/陰性對照組平均扭體次數(shù)×100%

123細胞培養(yǎng)與給藥方法

1231工作液的配制石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4個部位分別加DMSO配制濃度為2 mg/mL母液，-20 ℃保存，實驗時用10%FBS培養(yǎng)基將石油醚部位稀釋成100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL；將氯仿部位西施至50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL；將乙酸乙酯部位稀釋至100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL；將正丁醇稀釋至200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL（保證細胞毒性不能過大）。LPS加PBS配制濃度為125 mg/mL母液，-20 ℃保存，實驗時用10%FBS培養(yǎng)基稀釋成100 μg/mL模型工作液。

1232RAW2647細胞培養(yǎng)RAW2647細胞在37 ℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1233RAW2647細胞活力檢測RAW2647細胞按3×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后吸去原培養(yǎng)基，更換2%FBS培養(yǎng)基饑餓12 h。饑餓后，實驗組每孔分別加入不同濃度的實驗工作液100 μL；陰性對照組和模型組均加入10%FBS培養(yǎng)基100 μL（均設3個復孔）。培養(yǎng)1 h后，模型組和實驗組每孔加入LPS工作液1 μL（此時LPS濃度為1 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)36 h。36 h后吸取上層培養(yǎng)液至離心管，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μL，再加入新配制的5 mg/mL MTT液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，置搖床上低速振蕩10 min后，用酶標儀于490 nm處測量各孔的吸光度值（OD490 nm）。

細胞活力=（藥物孔OD值-調(diào)零孔OD值）/（陰性對照孔OD值-調(diào)零孔OD值）×100%

1234NO含量測定收集至離心管的上層培養(yǎng)液，4 000 r/min離心5 min，取上清。采用NO檢測試劑盒測定上清中NO含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

13統(tǒng)計學方法小鼠醋酸扭體法模型采用SPSS 190統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用因素方差分析。RAW2647細胞抗炎模型采用GraphPad502軟件繪圖，組間比較采用t檢驗。以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

21東北鐵線蓮不同部位的鎮(zhèn)痛活性利用小鼠醋酸扭體疼痛模型對東北鐵線蓮不同部位的鎮(zhèn)痛活性進行篩選，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位中劑量的小鼠扭體抑制率最高，高達6191%。見表1、表2。同時發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位鎮(zhèn)痛活性最強。見圖1。

22東北鐵線蓮不同部位的抗炎活性采用RAW2647細胞炎性反應模型檢測東北鐵線蓮不同部位的抗炎活性，乙酸乙酯部位濃度高達100 μg/mL時出現(xiàn)較弱的細胞毒性；正丁醇部位10 μg/mL也具有較弱的細胞毒性。見圖2。NO抑制實驗結果顯示氯仿、乙酸乙酯部位的抗炎效果較明顯，其中乙酸乙酯部位對NO的抑制呈濃度依賴性，且濃度為60 μg/mL時抗炎效果最好。見圖3。

3討論

炎性反應發(fā)生時機體組織會分泌許多抗炎因子來保護組織免受損傷，當持續(xù)過量產(chǎn)生促炎因子會使調(diào)節(jié)網(wǎng)絡失衡，進而誘發(fā)炎性反應的級聯(lián)反應。威靈仙作為傳統(tǒng)的中藥，近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，但是對于東北鐵線蓮的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究和不同提取部位間作用的差異性鮮有文獻報道，僅有學者研究證明了東北鐵線蓮的醇提取物[2]、根部提取物[3]和少數(shù)單體[58]可以通過抑制炎性反應因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。因此，本研究采用LPS刺激的RAW2647細胞炎性反應模型和小鼠醋酸扭體反應模型，比較東北鐵線蓮不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性差異。實驗發(fā)現(xiàn)東北鐵線蓮石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能不同程度抑制RAW2647細胞分泌產(chǎn)生NO和醋酸誘導小鼠扭體次數(shù)，且乙酸乙酯部位抗炎鎮(zhèn)痛活性最強。

小鼠腹腔注射醋酸后能夠引起行為學改變即發(fā)生扭體反應，這一模型是實驗中常用的與疼痛相關的模型，如有學者利用此模型研究了膽堿和對乙酰氨基酚的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用及其機制[9]，另有學者利用此模型進行了中藥提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[10]。本文研究了東北鐵線蓮不同提取部位對小鼠扭體次數(shù)的抑制率，進而比較其鎮(zhèn)痛作用的強弱。

LPS刺激RAW2647細胞炎性反應模型是研究炎性反應的經(jīng)典模型，有多位國內(nèi)外學者利用這一模型進行炎性反應研究[2，7，11]。NO是由一氧化氮合酶催化合成的氣體分子，具有介導炎性反應的功能，LPS刺激與炎性反應有關的一氧化氮合酶的表達，促使NO水平升高[12]。因此抑制機體NO的產(chǎn)生是治療炎性反應的重要手段。本實驗結果表明，RAW2647細胞經(jīng)LPS刺激后NO含量明顯增加，用東北鐵線蓮不同部位處理后，NO的產(chǎn)生受到了明顯的抑制，且乙酸乙酯部位抑制作用最顯著。

綜上所述，東北鐵線蓮具有潛在的抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用，其不同提取部位均能抑制醋酸誘導小鼠的扭體反應和LPS誘導RAW2647的NO分泌，并且乙酸乙酯部位效果最為顯著。目前的研究初步證實，抑制炎性反應因子的產(chǎn)生是東北鐵線蓮不同提取部位發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的機制之一，且乙酸乙酯部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用最強，但是發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的具體成分和作用機制有待進一步研究。

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（2017-11-10收稿責任編輯：張雄杰）