玉米太空誘變核不育突變體矮化性狀的QTL定位及分析

牛群凱，楊 聰，時子文，曹墨菊

（四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所/農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，成都 611130）

玉米是世界范圍內(nèi)種植面積最廣泛的作物之一。玉米對我國糧食增產(chǎn)的貢獻率要明顯高于水稻與小麥[1]，因此提高玉米產(chǎn)量是保障我國糧食安全重要的一步。利用玉米雄性不育系制種不僅能夠省去人工去雄的繁雜勞動，同時可提升種子純度。近年來由于SPT技術(shù)的出現(xiàn)有效解決了玉米隱性核不育系的保持與繁殖問題，故利用細胞核雄性不育系進行不育化制種已成為玉米雜交種制種技術(shù)的重要發(fā)展方向。

從玉米雄蕊原基開始分化直到成熟花粉粒形成期間，任何一個發(fā)育過程受阻都可能影響雄蕊的正常發(fā)育，導致敗育的發(fā)生。例如ms32基因能使造孢組織發(fā)生額外的周緣細胞分裂，形成多余的壁細胞并不斷向內(nèi)擠壓造孢細胞，同時絨氈層細胞液泡化喪失功能，使花粉母細胞畸形失活[2]；ms8基因能使花粉母細胞在減數(shù)分裂中期后積累過多的胼胝質(zhì)，導致花粉母細胞在第一次減數(shù)分裂后形成多核四分體，隨后花粉逐漸解體[3]；ms26基因與花藥角質(zhì)層和花粉外壁的形成有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)該基因能使絨氈層細胞高度液泡化，最終導致花粉解體[4]；ipe1基因使花藥角質(zhì)層和烏氏體的形成受阻，同時發(fā)現(xiàn)孢粉素隨機堆積和花粉粒外壁不規(guī)則，致使小孢子逐漸解體[5]；T.Fox等[6]對玉米顯性雄性不育基因Ms44進行研究，發(fā)現(xiàn)由于突變體中的單堿基突變導致在Ms44蛋白的信號肽切割位點處由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸，阻礙了蛋白質(zhì)的加工和絨氈層細胞中蛋白質(zhì)的分泌從而導致雄性不育，不育株由于雄穗的敗育使雌穗的氮素利用率增加，使單株產(chǎn)量得到提升。由此可見，今后對雄性不育系的利用將更加的多元化。

第一次綠色革命的出現(xiàn)得益于矮稈、半矮稈材料的利用。因此，株高這一性狀受到育種家們的廣泛關(guān)注。隨著分子標記技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，有關(guān)株高QTL的研究取得了長足的進步并定位到了一系列株高QTL，張志明等[7]利用R15×掖478組配的F2群體定位到11個株高、穗位高QTL，分布于第 2、3、4、5 和 8 號染色體上；嚴建兵等[8]利用 K22×C17、K22×Dan340 的 F2群體在 1、5、6、7、9 號染色體上都定位到株高QTL。湯繼華等[9]以自交系豫玉22的“永久F2”和RIL群體分別定位到12個和10個株高QTL，分布于第1，3，4，5和9號染色體。目前在MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）網(wǎng)站已經(jīng)收錄了共314個控制株高的QTL，這些QTL在玉米10條染色體上都有分布。Lin Y.R.等[10]通過總結(jié)他人研究發(fā)現(xiàn)玉米株高QTL主要集中分布在染色體bin1.06、bin1.08、bin3.04～3.06、bin8.05～8.06 和 bin10.3～10.4區(qū)域內(nèi)，其中的一些主效QTL也被相繼克隆。目前已報道的玉米株高相關(guān)基因有d1、na1、br2、yd2等，這些控制株高的基因通常都參與赤霉素、油菜素內(nèi)酯、生長素等植物激素的合成、運輸和信號傳導等過程。Teng F.等[11]利用綜3及其單片段導入系SL15成功克隆了一個主效株高QTL，研究發(fā)現(xiàn)該基因（ZmGA3ox2）編碼參與赤霉素合成的GA3-β羥化酶。Xing A.等[12]利用重組自交系RIL88定位到一個主效株高位點qph1，研究發(fā)現(xiàn)該突變體的矮化是由于在Brachytic 2基因第5外顯子處出現(xiàn)了一個堿基突變所致，通過抑制生長素的極性運輸導致株體矮小。

人工創(chuàng)制矮敗材料最早在小麥中獲得成功，1986年中國農(nóng)業(yè)科學院劉秉華等[13]利用雜交的方法將矮稈基因Rht-Dlc和太谷核不育基因Ms2進行聚合，創(chuàng)制出Rht-Dlc和Ms2緊密連鎖的“矮敗小麥”，該材料的創(chuàng)制為提高小麥的群體改良效率奠定了重要的材料基礎(chǔ)。但這種通過人工雜交聚合不育與矮化性狀的方法費時費力，因此通過誘變育種選育兼具雄性不育又能夠降低植株高度的矮化不育突變體是最為簡單有效的方法。

1996年四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所利用返回式衛(wèi)星搭載川單9號玉米種子，在其后代中得到一份受隱性單基因控制的雄性核不育突變體。該不育基因已被定位在第3染色體長臂[14]，命名為ms39。經(jīng)過多年觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不育株伴隨著植株矮化的現(xiàn)象，不育株矮化的同時還伴隨著雄穗分枝數(shù)及雄穗長度的減少。本研究以不育株（ms39）與自交系B73雜交的F2代為作圖群體，構(gòu)建了相應的分子遺傳圖譜，對株高、穗位高、雄穗分枝數(shù)、雄穗長度4個性狀進行QTL定位，旨在探討該核不育材料不育與矮化之間的遺傳關(guān)系，發(fā)掘相應的矮化基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以從衛(wèi)星搭載川單9號（48-2×5003）種子后代中選育的雄性不育突變體（見圖1）為材料，在姊妹交后代中選擇株高與可育株存在較大差異的不育株做母本，與自交系B73雜交構(gòu)建（ms39ms39×B73）F2群體。

1.2 田間試驗及性狀測定

2016年春，在四川溫江試驗基地種植（ms39ms39×B73）F2群體，并對群體內(nèi)120個單株進行各個性狀的表型鑒定。在植株散粉期按D.N.Duvick[15]提出的玉米雄花育性5級分級標準對每個單株的育性進行鑒定，每隔兩天調(diào)查一次育性，直到群體中每個單株散粉期結(jié)束為止。在植株抽絲期后，測量每個單株的株高、穗位高、雄穗分枝數(shù)及雄穗長度。株高（PH）為測量從植株基部至主莖頂部的距離；穗位高（EH）為測量植株基部至果穗第一著生節(jié)的距離；雄穗分枝數(shù)（TBN）為統(tǒng)計雄穗中除主穗之外的一級分支數(shù)；雄穗長度（TL）為測量雄穗主軸的最頂端至主軸下部的第一個分枝著生處的距離。

圖1 姊妹交群體中矮化不育株與可育株的比較Figure1 Comparison of dwarf sterile and fertile lines in sister cross population

1.3 遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位

利用CTAB法提取不育株（ms39）、B73及（ms39 ms39×B73）F2群體中120個單株的DNA，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對覆蓋全基因組的1 277對分子標記進行雙親間多態(tài)性篩選，其中包括1 114對SSR和163對Indel標記。首先將各多態(tài)性標記按其所在物理位置進行染色體歸類，然后檢測群體中每個個體的基因型。利用軟件mapmaker 3.0根據(jù)群體基因型數(shù)據(jù)計算各標記間的遺傳距離（cM），結(jié)合表型數(shù)據(jù)基于完備區(qū)間作圖方法（ICIM）的IciMapping Version 3.0軟件中ICIM-ADD（加性-顯性）模型，抽樣1 000次逐步迭代（顯著水平＜0.05），匹配2 cM的基因組掃描速度，構(gòu)建相應的遺傳圖譜并對（ms39 ms39×B73）F2群體的株高、穗位高、雄穗分枝數(shù)及雄穗長度進行QTL定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不育性狀的遺傳分析

通過田間育性調(diào)查發(fā)現(xiàn)在120株的（ms39ms39×B73）F2群體中共包含92株可育株與28株不育株，可育株與不育株的分離比例經(jīng)卡平方檢驗符合3∶1（χ2=0.09，P＞0.05），再次驗證該雄性不育突變體的育性由一對隱性核基因控制。

2.2 定位群體株高及相關(guān)性狀的表型分布

通過對（ms39ms39×B73）F2群體 120個單株的株高、穗位高、雄穗長度、雄穗分枝數(shù)進行作圖統(tǒng)計（見圖2），發(fā)現(xiàn)各性狀均表現(xiàn)出數(shù)量遺傳的特征。F2群體的株高在134.8～273.0 cm范圍內(nèi)連續(xù)分布，但在190～200 cm與220～230 cm兩個范圍均出現(xiàn)一個峰值，“雙峰”現(xiàn)象的出現(xiàn)說明（ms39ms39×B73）F2群體中可能存在一個控制株高的主效位點?？捎昶骄旮邽?12.4 cm，不育株平均株高為173.9 cm，群體中除一株不育株株高達到204.6 cm外，其余不育株株高均分布于200 cm以下，說明群體中的大多數(shù)不育株矮于可育株，但也存在極少數(shù)“高稈不育株”；同時發(fā)現(xiàn)一株可育株的株高僅為138.6 cm，表明群體中同樣也存在“矮稈可育株”。

（ms39ms39×B73）F2群體的穗位高在 41.1～101.4 cm范圍內(nèi)分布。與株高數(shù)據(jù)分布相似，不育株的穗位高均在80 cm以下，可育株的穗位高均高于80 cm，表明植株表現(xiàn)不育的同時也伴隨著穗位高降低的現(xiàn)象。群體中不育株的雄穗長度在12.1～24.0 cm范圍內(nèi)，可育株的雄穗長度在11.2～31.2 cm范圍內(nèi)，雄穗長度最大及最小植株的育性均為可育。不育株雄穗分枝數(shù)在5～14范圍內(nèi)，可育株雄穗分枝數(shù)在4～17范圍內(nèi)，雄穗分支數(shù)最大及最小植株的育性也均為可育。雄穗長度及分支數(shù)分布的這一特點與株高及穗位高有所不同，在株高及穗位高最低的植株中同時存在可育株與不育株，而雄穗長度最小及雄穗分支數(shù)最低的植株均為可育株。

2.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

通過對分布于10條染色體上的1 277對引物進行雙親間多態(tài)性篩選，得到180對多態(tài)性分子標記用于群體基因型檢測，其中包含71對Indel標記與109對SSR標記。在10條染色體上的引物及多態(tài)性標記的分布如表1所示。利用多態(tài)性標記對F2群體內(nèi)所有單株進行基因分型，部分結(jié)果如圖3所示。將180對多態(tài)性標記對120個單株的基因分型結(jié)果匯總，利用IciMapping Version 3.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（見圖4），該圖譜總長度為1 173.4 cM，標記間的平均間距為6.63 cM。

由于本課題組前期已把該雄性核不育突變體的不育基因（ms39）定位于玉米第3染色體長臂，介于分子標記 mmc0071（物理位置：205，258，950）與umc2276（物理位置：213，258，950）之間，所以通過對第3染色體進行標記加密，重點關(guān)注在不育基因定位區(qū)間附近是否存在株高QTL，結(jié)果在第3染色體的262對分子標記中篩選到53對多態(tài)性標記用于群體基因型檢測。第3染色體遺傳圖譜的長度為142.06 cM，標記間的平均間距為2.68 cM。

圖2 (ms39ms39×B73)F2群體性狀頻率分布圖Figure2 Frenquency distribution of several traits investigated with in(ms39ms39×B73)F2population

表1 （ms39ms39×B73）F2群體多態(tài)性分子標記分布表Table1 Distribution of polymorphism molecular markers in（ms39ms39×B73）F2population

圖3 利用分子標記umc2075檢測F2群體基因型Figure3 The electrophoretic result of part of F2plants was detected by umc2075

圖4 目標性狀QTL在遺傳圖譜上的分布Figure4 Distribution of QTL for objective traits on genetic linkage maps

表2 （ms39ms×B73）F2群體目標性狀QTL定位結(jié)果Table2 The QTL for objective traits in（ms39ms39×B73）F2population

2.4 目標性狀QTL定位

利用軟件IciMapping Version 3.0進行1 000次排列獲得QTL顯著的LOD閾值均為2.5。通過對（ms39ms39×B73）F2群體進行株高、穗位高、雄穗主穗長度、雄穗分枝數(shù)的QTL定位，共檢測到9個QTL，具體分布如表2所示。其中包含4個株高QTL，分別分布在第 1、3、4、10 號染色體上；qPH1-1 位于標記 umc2224～chr1-45344303之間，LOD 值為 3.38，表型貢獻率為 9.54%；qPH3-1位于標記 chr3-208370127～chr3-208867728之間，LOD 值為 10.65，表型貢獻率達到26.96%；qPH4-1位于標記bnlg2162～chr4-195559120之間，LOD值為3.22，表型貢獻率為7.05%；qPH10-1位于標記umc2067～umc1336之間，LOD值為2.91，表型貢獻率為6.35%。在第3染色體上掃描到一個主效株高位點qPH3-1，該株高位點與不育基因定位區(qū)間幾乎一致，說明該位點是引起不育株株高降低的主要原因。

同時利用該群體定位到2個穗位高QTL，qEH3-1位于第3染色體分子標記chr3-213688479～chr3-214915917之間，LOD值為4.05，表型貢獻率為 12.96%；qEH4-1位于第 4染色體分子標記dupssr34～bnlg2162之間，LOD值為3.01，表型貢獻率為9.9%。在第3染色體上定位到一個控制雄穗長度的QTL，qTL3-1位于分子標記chr3-195169521～chr3-201259136之間，LOD值為2.67，表型貢獻率為9.13%。在第2、4染色體上各定位到一個控制雄穗分支數(shù)的QTL，qTBN2-1位于分子標記umc1536～umc2085之間，LOD值為 3.23，表型貢獻率為11.67%；主效位點qTBN4-1位于分子標記dupssr34～bnlg2162之間，LOD值為6.78，表型貢獻率為24.02%。該主效位點qTBN4-1目前已被克隆，G.S.Chuck等[16]研究發(fā)現(xiàn)unbranched3基因編碼一個SBP-box轉(zhuǎn)錄因子從而影響玉米的雄穗分枝數(shù)與穗行數(shù)。

qPH3-1、qEH3-1、qTL3-1 都存在于第 3 染色體長臂且與不育基因所在位置相距較近，暗示著這3個QTL與不育基因存在連鎖關(guān)系。同時這3個位點的加性效應均為正值，表明父本B73攜帶的相應等位基因起到增加株高、穗位高和雄穗長度的作用，母本不育株攜帶的相應等位基因起到降低株高、穗位高和雄穗長度的作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 在玉米核不育基因ms39定位區(qū)段附近檢測到株高QTL位點

本研究通過對玉米太空誘變核不育株與B73組配的（ms39ms39×B73）F2群體進行株高 QTL掃描，在不育基因（ms39）定位區(qū)間附近檢測到一個主效株高QTL，qph3-1，其表型貢獻率高達26.96%。許多學者在不同環(huán)境下、利用不同的群體均在玉米第3染色體檢測到控制株高的QTL。鄭克志等[17]利用玉米自交系T319與9406為親本，在玉米bin3.06位點定位到的株高QTL可解釋12.99%的表型變異；李清超等[18]利用玉米骨干親本黃早四與其他11個骨干自交系組配的11個RIL群體，在玉米bin3.05～3.06間掃描到8個株高、穗位高QTL；鄭德波等[19]以K22×CI7 、K22×Dan340 的 F2群體，在 bin3.06定位到4個株高QTL，可解釋表型變異率分別為6.40%、7.92%、8.26%、10.69%。在玉米第3染色體上控制株高的基因有d1、sdw2、yd2和na1，分別存在于bin3.02、bin3.05、bin3.06、bin3.07 位點[20]。這些結(jié)果一致表明玉米第3染色體bin3.05～3.06區(qū)間可能是株高QTL的富集區(qū)域，且玉米太空誘變核不育基因ms39也被定位于該區(qū)域附近。

在（ms39ms39×B73）F2群體中雖然不育株大多矮于可育株，但也存在“高稈不育株”與“矮稈可育株”，針對這種現(xiàn)象可從兩個方面進行解釋：一方面，“高稈不育株”與“矮稈可育株”的出現(xiàn)，暗示著不育基因與矮化基因可能是相互連鎖的，通過雜交重組打破了基因間的連鎖關(guān)系，所以在后代群體中出現(xiàn)了“高稈不育株”與“矮稈可育株”的現(xiàn)象；另一方面，由于株高是典型的數(shù)量性狀，其他微效株高QTL也可能對不育株和可育株的株高產(chǎn)生影響，導致“高稈不育株”與“矮稈可育株”的形成。

3.2 矮敗材料是植物基礎(chǔ)研究和育種應用的重要資源

玉米雄性核不育突變體ms39伴隨著植株高度的明顯降低，這一矮敗材料是從太空誘變后代中選育而來。目前關(guān)于雄性不育材料伴隨株高降低的這一現(xiàn)象，在其他植物中也存在類似報道。例如棉花中的SDA基因能導致植株發(fā)生雄性不育且伴隨著植株矮化現(xiàn)象，Wu C.等[21]研究發(fā)現(xiàn)SDA基因與脫落酸（ABA）的生物合成及信號傳導途徑有關(guān)；林冰等[22]對水稻OsOFP2與OsOFP1基因分別進行過量表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出花藥敗育及矮化的現(xiàn)象，推測OsOFP2與OsOFP1表達量升高能抑制赤霉素的合成影響植株的生長發(fā)育。

雄花發(fā)育和植株生長是植物生長發(fā)育的兩個重要方面，有研究表明一些轉(zhuǎn)錄因子會通過調(diào)節(jié)植株的生長發(fā)育來影響植株的育性及株高，例如MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的基礎(chǔ)代謝及生長發(fā)育環(huán)節(jié)中扮演重要角色，Yang X.Y.等[23]發(fā)現(xiàn)AtMYB24基因?qū)儆跀M南芥R2R3-MYB基因家族，該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子與花藥發(fā)育和植株的生長有著密切關(guān)系；陳利維等[24]在水稻中分離獲得了一個新的OsMYB106基因，通過RNA干涉試驗發(fā)現(xiàn)植株表現(xiàn)出花粉敗育及矮化現(xiàn)象；張娟等[25]發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的WRKY51在水稻中超表達后植株表現(xiàn)出超級矮化及敗育等性狀，推測該基因在水稻生長發(fā)育階段起到重要調(diào)控作用。這些不育基因和轉(zhuǎn)錄因子大多與植物的生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，能同時影響植株的高度與育性。

雄性不育在植物雜種優(yōu)勢利用上具有重要的應用價值。將其他一些重要的育種目標性狀聚合到不育材料中，將大大提高雜交育種的效率。Afsana Ansari等[26]通過對半矮化基因sd-1與絨氈層特異性基因RTS進行RNA干涉創(chuàng)制了一種人工矮敗不育水稻；劉秉華等[27]則通過雜交聚合的方法創(chuàng)制出“矮敗小麥”。由此可見，矮敗材料在植物基礎(chǔ)研究和育種應用中具有重要的應用價值。

本研究中的玉米太空誘變核不育突變體能夠明顯降低植株的株高，前期已將該不育基因定位于第3染色體長臂，本研究通過全基因組作圖和QTL定位，在不育基因定位區(qū)間的附近檢測到一個影響植株高度的主效QTL，推測該不育突變體的矮化可能是由于控制株高的QTL與不育基因的連鎖所致。前人的研究也表明在玉米第3染色體的長臂上存在一個控制株高的QTL富集區(qū)，這些都為進一步認識該核不育突變材料矮化現(xiàn)象的遺傳機理奠定了基礎(chǔ)。