豬德爾塔冠狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立

陳小金，張 霞，王玉玲，董志珍

（天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300456）

腹瀉是影響豬群生產(chǎn)的一種常見的多發(fā)性疾病。引起腹瀉的病原多而復雜，其中豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒是目前常見仔豬腹瀉病毒性病原[1-2]。2013年張志等[3]對我國5省份的部分規(guī)模豬場開展研究，發(fā)現(xiàn)豬場的腹瀉流行率達71.99%。2014年美國23個州暴發(fā)了2 692起腹瀉疫情。其他國家，如德國、法國、瑞士、意大利、韓國、泰國和越南等，也在近幾年相繼暴發(fā)過腹瀉疫情，造成了嚴重經(jīng)濟損失[4-5]。由此可見，腹瀉已成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。而變異毒株和新型病毒的出現(xiàn)更增加了其防控難度。因而，引起腹瀉的相關病毒備受關注，

2014年美國俄亥俄州豬場發(fā)生腹瀉疫情，臨床癥狀與流行性腹瀉相似。調查發(fā)現(xiàn)，引起該疫情的病原并非豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRoV）和沙門氏菌，經(jīng)電鏡檢測最終確定病原為PDCoV[6]。明尼蘇達大學獸醫(yī)診斷實驗室和愛荷華州立大學提交兩株PDCoV全基因組序列，檢測發(fā)現(xiàn)其與Patrick等報道的PDCoV HKU15-155和HKU15-44毒株序列高度同源[7-9]。2014年4—6月韓國學者從腹瀉豬場樣本中檢出PDCoV，并發(fā)現(xiàn)其與我國香港毒株和美國毒株的同源性分別為98.8%～99.0%和99.6%～99.8%[10]。Marthaler等[9]對美國部分地區(qū)2014年1—2月的豬場樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)PDCoV陽性率為30%，表明PDCoV在美國中東部地區(qū)普遍存在；此外，約22%樣品是PDCoV單獨感染，58%樣品為混合感染，其中和PRoV混合感染的比例最大。Ma等[11]對PDCoV Ohio CVM1毒株進行研究，證實PDCoV可以引起仔豬腹瀉、嘔吐、脫水等類似豬傳染性胃腸炎和流行腹瀉的臨床癥狀，同時發(fā)現(xiàn)PDCoV能夠引起明顯的胃部病變以及輕度肺部病變。

目前針對PDCoV檢測方法的研究相對較少。少量文獻報道已有研究人員建立了RT-PCR、探針法熒光PCR、ELISA檢測方法[9，12-18]。SYBR Green I 熒光PCR具有操作簡便、成本低等優(yōu)點，可廣泛應用于基層實驗室。本研究以染料法為基礎，建立針對PDCoV的SYBR Green I的熒光定量PCR方法，旨在豐富PDCoV檢測技術體系，為進出境活豬病毒性腹瀉疫病檢測以及防控與預警提供技術手段，為防止外來重要動物疫病傳入提供保障，同時為疫苗的評價，以及病原體在動物機體內的動態(tài)分布、細胞培養(yǎng)中的病毒滴度等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞系及臨床病料

試驗中使用的病毒株均為疫苗毒，包括豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。待檢樣品為2017年收集的國內部分省份豬場腹瀉糞便及2017年本實驗室收集的進境種豬糞便拭子（源自加拿大和美國）。

1.2 主要試劑及儀器

隨機引物：購于Promega公司；pUC19、Premix ExTaq、SYBR Green I熒光PCR預混液、載體、Easy dilution buffer：購自大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、Rayscript cDNA Synthesis試劑盒：購自上海捷瑞生物技術有限公司；Axygen DNA Gel Extraction Kit：購自Axygen公司。

旋渦震蕩器QL-861：購自江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；潔凈工作臺SW-CJ-2D：購自蘇州凈化設備有限公司；臺式高速冷凍離心機Neofuge13R：購自上海力申科學儀器有限公司；普通PCR儀：購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；金屬恒溫連接儀：購自Eppendorf公司；移液器：購自德國Eppendorf公司；NanoDrop 5000：購自美國Thermo；電泳儀Mini Pro 300 V：購自美國Power supply major science公司；電泳槽Labnet Sub System 70：購自美國Labnet公司；Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀：購自德國QIAGEN公司。

1.3 引物設計與合成

參照GenBank登錄的PDCoV基因序列，對不同毒株基因進行序列比對，篩選M基因保守區(qū)域，并以其為靶基因設計2對特異性引物，預期擴增目的片段長度分別為235和108 bp。上述引物由上海捷瑞生物技術有限公司合成，特異性引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 模板制備及病毒核酸的提取和反轉錄

取500 mg陽性糞便樣品加入500 μL滅菌生理鹽水，以5 000 r/min的轉速4 ℃離心30 min，棄沉淀保留上清。取100 μL上清，加入200 μL RnaExTM試劑，漩渦震蕩器上振蕩混勻破碎細胞5～20 s（2～3次），加入500 μL RnaExTM試劑，顛倒混勻，室溫裂解5 min。加入0.2 mL氯仿，漩渦振蕩，室溫靜置2 min。12 000 r/min、4 ℃離心10 min。取400 μL上清加入到無菌無RNA酶的1.5 mL EP管中，按2：1的比例加入200 μL無水乙醇，充分混勻，然后將上述溶液全部轉移到套放于2 mL收集管內的吸附柱中。8 000 r/min 4 ℃離心1 min，除去收集管中的廢液。加入500 μL Buffer RWA，12 000 r/min 4 ℃離心1 min，除去收集管中的廢液。重復用Buffer RWA洗1次。12 000 r/min 4 ℃離心1 min，除去收集管，將柱子放入無菌無酶的1.5 mL離心管中，晾干2 min，在柱內膜的中央小心加入50 μL DEPC水溶解RNA，室溫2 min。12 000 r/min 4 ℃離心1 min，收集RNA置于-70 ℃保存。

以上述方法提取的RNA為模板，用Rayscript cDNA Synthesis KIT進行反轉錄，合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。反應體系30 μL：Random primer 1.0 μL、隨機引物 1.0 μL、5×RT Buffer 6.0 μL、dNTP 1.0 μL、Rnase Inhibitor 1.0 μL、M-MLV反轉錄酶1.0 μL、RNA 12.0 μL，用H2O補至30 μL。反應程序為：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min。

1.5 標準品鑒定和制備

以cDNA板進行PCR反應，反應體系為25 μL，具體如下：2×Premix Ex Taq緩沖液12.5 μL，MF和MR各（10 pmoL/mL）1.0 μL，cDNA模板2 μL，最后用滅菌去離子水補至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用Axygen DNA Gel Extraction Kit回收，將目的片段克隆到 pUC19載體，并轉化大腸桿菌DH5-α中。搖菌篩選陽性克隆，提取質粒，并對重組陽性質粒PCR鑒定、測序，篩選基因序列正確的質粒作為標準品。用紫外分光光度計檢測質粒濃度，根據(jù)公式換算質粒濃度到copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 熒光定量PCR反應條件優(yōu)化及標準曲線建立

通過對熒光定量PCR反應體系中的引物濃度和反應條件等進行篩選和優(yōu)化，最終確定的反應體系為：RE-F和RE-R（10 pmol/mL）各0.8 μL，模板1.0 μL，SYBR Green I 反應液10.0 μL，滅菌去離子水補充至總體積20 μL；最佳反應條件為95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，40個循環(huán)。用Easy dilution buffer將質粒pUC19-M進行10倍梯度稀釋以制備標準品，以不同濃度標準品為模板，在Rotor Gene熒光定量PCR儀上進行檢測，獲得擴增動力學曲線，并依此繪制標準曲線。

1.7 實時熒光定量PCR評價

1.7.1 特異性試驗 本試驗以幾種常見豬病疫苗毒為參照進行特異性試驗。分別提取PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV的RNA，以最佳反應體系和最佳反應條件，在Rotor Gene熒光定量PCR儀上進行操作，試驗中同時設立陰性和陽性對照。

1.7.2 敏感性試驗 梯度稀釋已知濃度的重組質粒（2.49×108～2.49×100copies/μL），吸取1.0 μL不同濃度質粒作為模板，進行Real-time PCR，得出本研究所建立的檢測方法所能檢出的最低拷貝數(shù)。同時取上述相同體積質粒作為模板進行常規(guī)PCR，以比較兩種方法的敏感性。

1.7.3 重復性試驗 選取3個已知濃度標準品（2.49×106、2.49×104、2.49×102）作為批間和批內重復試驗的模板進行Real-time PCR，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。上述3個濃度標準品分別設立3個重復，在同一反應條件下同時檢測，通過分析試驗所得的Ct值進而計算批內變異系數(shù)；將上述3個濃度標準品置-20 ℃保存，每次間隔1周連續(xù)檢測3次，通過分析試驗所得的Ct值計算批間變異系數(shù)。

1.8 臨床樣品檢測

將2017年收集的62份糞便樣品及1 168份進境種豬糞便拭子，按照1.4所述方法提取RNA并反轉錄成cDNA，以最佳反應體系和反應條件進行Realtime PCR檢測，同時以上述樣品的cDNA作為模板進行常規(guī)PCR檢測，對比兩種方法的檢測結果。

2 結果

2.1 目的片段擴增

以設計的RE-F、RE-R特異性引物進行PCR擴增，獲得大小為108 bp的目的片段。測序結果顯示，試驗擴增的目的片段與親本PDCoV基因序列的一致性為100%（圖1）。以MF和MR擴增獲得的M基因（擴增長度為235 bp，圖1），用于與載體pUC19連接構建重組質粒，并作為標準品。

圖1 PDCoV引物特異性的PCR 鑒定

2.2 標準曲線建立

提取陽性重組質粒，并用紫外分光光度計測得質粒DNA的濃度為527 ng/μL，經(jīng)過計算得出其拷貝數(shù)為2.49×109copies/μL，對該質粒進行10倍梯度稀釋，選擇2.49×108～2.49×102copies/μL的質粒作為標準品。

圖2 標準品的動力學曲線

將質粒標準品按照最佳反應條件進行Realtime PCR反應，發(fā)現(xiàn)質粒濃度在2.49×108～2.49×102copies/μL之間呈現(xiàn)良好的線性關系。擴增曲線（圖2）分析表明，曲線1、2、3、4、5、6、7分別為模板濃度是2.49×108、2.49×107、2.49×106、2.49×105、2.49×104、2.49×103、2.49×102copies/μL的質粒標準品動力學曲線；質粒標準品從2.0×108～2.0×102copies/μL的Ct值分別為8.31、11.47、14.77、18.18、21.53、24.57、27.00。標準曲線分析表明，斜率為-3.18，x軸截距為35.13，直線方程為y=-3.18x+35.13，相關系數(shù)（R2）為0.998，擴增效率為1.06（圖3）。

圖3 標準曲線

2.3 特異性

采用Real-time PCR檢測PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV不同病毒的RNA，結果均為陰性，其特異性擴增曲線見圖4。

圖4 特異性試驗結果

2.4 重復性

采用Real-time PCR，對2.49×106、2.49×104、2.49×102copies/μL的標準品分別進行批內重復試驗及批間重復試驗，發(fā)現(xiàn)批內變異系數(shù)分別為0.99%、0.67%、1.00%，批間變異系數(shù)分別為2.85%、1.70%、2.04%（表2）。以上結果顯示，3個不同濃度標準品作為模板進行Real-time PCR反應所得Ct值的批間和批內變異系數(shù)均小于3%，表明本研究所建立的方法具有很好的穩(wěn)定性。

表2 PDCoV熒光定量PCR重復性試驗數(shù)據(jù)分析

2.5 敏感性

以2.49×108～2.49×100copies/μL的質粒標準品為模板，對每個濃度1.0 μL進行實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR。結果顯示，Real-time PCR對質粒標準品的檢測下限為24.9 copies/μL，而常規(guī)PCR的檢測下限為2.49×103copies/μL（圖5、表3），表明Real-time PCR比常規(guī)PCR敏感約100倍。

圖5 熒光PCR敏感性

表3 敏感性試驗數(shù)據(jù)分析

2.6 樣品檢測

檢測2017年收集的豬腹瀉糞便樣品62份，應用Real-time PCR、常規(guī)PCR對病料進行檢測。結果顯示，在62份待檢樣品中，Real-time PCR檢出26份陽性，常規(guī)PCR 檢出16份陽性（表4）。檢測結果表明，本試驗建立的實時熒光定量PCR較常規(guī)PCR方法的檢出率更高。用上述兩種方法對2017年源自美國和加拿大的種豬糞便拭子進行檢測，發(fā)現(xiàn)均為陰性，二者一致性達100%。

表4 樣品PDCoV檢測結果 單位：份

3 討論

近期，病毒分類國際委員會提議將冠狀病毒分為4個屬，即α、β、γ和δ[19]，在PDCoV發(fā)現(xiàn)之前，δ冠狀病毒成員為鳥類冠狀病毒，以哺乳動物為宿主的冠狀病毒幾乎歸屬為α、β群。早在2012年，香港大學學者在進行冠狀病毒流行病學調查時，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該病毒，并將其歸為δ冠狀病毒[20]，只是當時并未引起重視。2014年美國暴發(fā)多起腹瀉疫情，經(jīng)鑒定為PDCoV引起，此時PDCoV才受到廣泛關注[5，7-8，11，17，21]。作為仔豬腹瀉新病原，PDCoV的出現(xiàn)給全球仔豬病毒性腹瀉防控帶來了新挑戰(zhàn)。因此，世界各國研究人員針對PDCoV開展了一系列研究，包括病毒基因序列分析、蛋白功能研究、病毒分離培養(yǎng)以及動物試驗、檢測方法建立（ELISA、RT-PCR、探針法熒光PCR）等[9，12-18]。本研究通過對GenBank上登錄的PDCoV國內外毒株基因序列分析，選擇最保守的M基因為靶基因設計特異性引物，建立了SYBR Green I熒光PCR方法，用于檢測該病毒。本實驗室檢疫的活豬來源于美國和加拿大。而這兩個國家都報道發(fā)生過PDCoV引起的腹瀉疫情，這就更突顯了口岸疫情監(jiān)測的重要性與必要性。

4 結論

本研究將SYBR Green I熒光PCR技術應用于PDCoV檢測。評價數(shù)據(jù)顯示，建立的方法具有較好的特異性，呈現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線為單一特異峰（Tm值為82.7 ℃），敏感性可達24.9 copies/μL，批內、批間變異系數(shù)均小于3%，表現(xiàn)出較好的重復性。用本研究所建方法和常規(guī)PCR同時對62分豬腹瀉糞便樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)前者檢出率更高；兩種方法對1 168份進境活豬糞便拭子的檢測符合率為100%。因此，該方法實現(xiàn)了快速、靈敏、特異的檢測目的，操作簡單且檢測成本低，可用于豬場分子流行病學調查及早期診斷，也可用于組織病毒載量研究。該方法的建立為PDCoV致病機理的研究奠定了基礎，同時為防止外來重要動物疫病傳入提供了技術手段和保障，有助于我國生豬檢驗檢疫體系的進一步完善。