豬細(xì)小病毒7型Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

張 志，張麗麗，，劉 爽，單 虎，李曉成，王樹雙

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266019）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）屬于細(xì)小病毒科，是一種單股非囊膜線性DNA病毒，基因組大小為4～6.3 kb[1]。PPV最早發(fā)現(xiàn)于1965年，主要引起母豬不孕不育，以及產(chǎn)死胎或木乃伊胎等繁殖障礙癥狀，是影響?zhàn)B豬業(yè)的重要疫病之一[2]。2016年P(guān)alinski等[3]首次從美國健康豬的棉拭子中，通過基因組測序鑒定出一種新的PPV亞型病毒，并將其命名為PPV-7。該病毒的ORF與狐蝠細(xì)小病毒2和火雞細(xì)小病毒TP1-2012/HUN 毒株之間的同源性分別為42.4%和37.9%，因此把這3種病毒歸為一個(gè)新的屬Chapparvovirus。

2017年我國Xing等[4]也從2014年保存的廣東省2個(gè)商品代豬場的豬血清中檢測到了PPV-7，表明我國已有PPV-7感染的存在，且至少可以追溯到2014年以前。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中用普通PCR方法也鑒定并分離到一株P(guān)PV-7病毒。為進(jìn)一步了解PPV-7在我國豬場的流行狀況，本研究以此病毒為參考毒株，構(gòu)建了PPV-7 Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR方法，并選擇我國部分省市的豬場樣品進(jìn)行了實(shí)際檢測。本方法的建立為開展PPV-7流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測和診斷等提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

96份豬病料：來自福建、山東、河南等省份，表現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、流產(chǎn)等臨床癥狀的發(fā)病豬群。

1.2 病毒

PPV-7病毒株SD10：本實(shí)驗(yàn)室鑒定和分離；豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV-3）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒1型（PPV-1）：本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存。

1.3 主要試劑

Real Time Taq 試劑盒（RR390A）、pMD-18T vector和DH5α感受態(tài)細(xì)胞：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病毒DNA提取試劑盒（DNAZol）：Life公司產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計(jì)

參考PPV-7基因組序列（KU563733）和文獻(xiàn)[10]的檢測方法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)1對(duì)新引物PPV7-F1和PPV7-R1，以及1條熒光探針引物PPV7-P1。序列分別為：

引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.5 樣品DNA提取

根據(jù)DNAzol說明書，從豬樣品中提取總基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備

以引物PPV7-F1和PPV7-R1為擴(kuò)增引物，以陽性樣品SD10提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取陽性克隆測序，提取質(zhì)粒并測定濃度，將此質(zhì)粒的濃度調(diào)整為 15 ng/μL（即 4.6×109copies/μL），作為PPV-7標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相關(guān)的熒光PCR試驗(yàn)。

1.7 熒光PCR方法建立

以陽性PPV-7的標(biāo)準(zhǔn)品樣品為模板，建立熒光PCR方法。配制的熒光PCR反應(yīng)體系包括：Premix EX-Taq反應(yīng)液12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）、下游引物（10 μmol/L）和熒光探針（5 μmol/L）各1 μL，DNA標(biāo)準(zhǔn)品2 μL，用 ddH2O 補(bǔ)充至 25 μL。熒光 PCR 的反應(yīng)擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃5 s、60 ℃14 s），60 ℃讀取熒光。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線建立和敏感性試驗(yàn)

將濃度為15 ng/μL的PPV-7陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍倍比稀釋，然后以10-2～10-8等7個(gè)稀釋度為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；將各濃度得到的Ct值為縱坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此基礎(chǔ)上確定熒光PCR的敏感性和最小檢測極限。

1.9 特異性試驗(yàn)

用建立的PPV-7熒光PCR方法，同時(shí)擴(kuò)增PCV-2、PCV-3、PRV、PPV-1等提取的DNA模板，觀察本方法檢測其他病原時(shí)的熒光PCR反應(yīng)結(jié)果，評(píng)價(jià)本方法的特異性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

將已知濃度的PPV-7陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和 10-8，分別進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)濃度分別用本方法重復(fù)檢測3次；組間重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)，分別在3個(gè)時(shí)間，用本方法重復(fù)檢測3次，最后對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)本方法的重復(fù)性。

1.11 實(shí)際應(yīng)用

采用建立的熒光PCR方法，對(duì)從臨床采集的96份豬樣品進(jìn)行檢測，通過擴(kuò)增的陽性結(jié)果，評(píng)價(jià)本方法在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備和濃度測定

以PPV-7病毒株SD10提取的DNA為模板，用引物PPV7-F1和PPV7-R1進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增到一條大小為117 bp的特異性條帶。該特異性條帶與pMD18-T載體連接和轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞后，從板上隨機(jī)挑選6個(gè)白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，再用PCR進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)樣品中，有4個(gè)可以檢測到117 bp大小的目的基因。將其中3條最亮條帶對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒樣品送去測序，并與PPV-7參考毒株KU563733進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)這3條帶與PPV-7參考毒株的同源性均為100%，表明這3個(gè)質(zhì)粒均含有PPV-7。將這3份質(zhì)?；鞓舆M(jìn)行濃度測定，發(fā)現(xiàn)為165.48 μg/μL；再用TE緩沖液調(diào)整濃度為15 ng/μL，并以此作為PPV-7陽性標(biāo)準(zhǔn)品，命名為PPV7-SD10。同時(shí)將質(zhì)粒pMD18-T空白載體也稀釋成15 ng/μL作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 熒光PCR方法建立

本研究中，引物和探針的加樣體積分別以0.5、1和2 μL加樣。另外，反應(yīng)條件篩選時(shí)選擇3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行不同組合，變性時(shí)間選擇了95 ℃ 1 min、2 min、3 min和5 min，退火溫度按照55～62 ℃間隔1℃，同時(shí)變性時(shí)間從10 s到30 s。將這些不同的反應(yīng)條件組合交叉進(jìn)行試驗(yàn)，通過多次試驗(yàn)優(yōu)化后，獲得最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件，即每一種引物均加入0.5 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，45 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 5 s、60 ℃ 14 s），60 ℃讀取熒光，此時(shí)獲得的反應(yīng)結(jié)果最好。

2.3 特異性試驗(yàn)

以陽性標(biāo)準(zhǔn)品PPV7-SD10的10-5稀釋的DNA為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果可以擴(kuò)增出一條特異性的“S”形曲線，同時(shí)用建立的熒光探針方法對(duì)PCV2、PCV3、PRV和PPV-1等其它DNA病毒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均沒有擴(kuò)增出特異性條帶，表明本方法對(duì)PPV-7具有較好的特異性，對(duì)其它DNA病毒無擴(kuò)增交叉反應(yīng)（圖1）。

圖1 PPV-7熒光PCR方法的特異性

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和敏感性試驗(yàn)

將構(gòu)建好的PPV7-SD10陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后的DNA為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)隨著模板拷貝數(shù)的降低，擴(kuò)增的Ct值逐漸增加，當(dāng)稀釋度達(dá)到原模板濃度的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和 10-8時(shí)，擴(kuò)增的 Ct值分別為 12.50、16.65、20.96、25.38、29.38、33.06 和35.01，擴(kuò)增曲線仍然為一條典型的“S”形曲線，但當(dāng)稀釋倍數(shù)遞減為10-9時(shí)，熒光PCR擴(kuò)增不出典型的“S”型曲線，表明本方法的檢測極限是樣品的10-9稀釋倍數(shù)（圖2）。以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度的反對(duì)數(shù)為橫軸，以對(duì)應(yīng)的Ct值為縱軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），可以得到相關(guān)的回歸方程：y=4.154 6x+4.292 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，說明Ct值與拷貝數(shù)之間呈現(xiàn)非常強(qiáng)的線性關(guān)系，表明本方法穩(wěn)定性好。對(duì)不同濃度的模板使用本方法進(jìn)行檢測，均可以得到較好的試驗(yàn)結(jié)果。

圖2 熒光探針方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 熒光探針方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

用上述稀釋倍數(shù)為 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的標(biāo)準(zhǔn)品為模板DNA，進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)3次重復(fù)的變異系數(shù)（CV）均小于2%，表明本方法的重復(fù)性較好（表1、圖4）。

表1 不同濃度模板進(jìn)行PPV-7熒光PCR重復(fù)性的變異結(jié)果

2.6 實(shí)際應(yīng)用

用建立的熒光方法，對(duì) 96份豬樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有52份樣品擴(kuò)增出典型的“S”型曲線（圖5），與陽性樣品結(jié)果一致，陽性率為54.2%，表明本方法是可行的，可用于PPV-7的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測。

3 討論

圖4 熒光PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖5 熒光探針PCR檢測臨床樣品PPV-7的結(jié)果

PPV在豬群中普遍存在，是豬群常見的多發(fā)性疫病[5]。最近幾年，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，除發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典的豬細(xì)小病毒（PPV-1）以外，還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了PPV2—PPV7等不同的亞型[6-9]，因此建立這些PPV亞型的快速、準(zhǔn)確、方便的檢測方法具有重要意義。

盡管病原檢測有PCR、納米PCR、SYBR Green熒光PCR等方法[10-12]，但基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR方法仍然是檢測病原最常用的方法。它具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特征，在病原檢測領(lǐng)域廣為應(yīng)用。豬瘟、口蹄疫等一大批動(dòng)物疫病病原檢測都已建立了實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[13-14]。本研究建立的PPV-7熒光PCR方法的最低檢測極限是45個(gè)病毒拷貝/μL，顯示出極高的檢測敏感性。這一檢測極限與孫文超等[12]建立的SYBR Green熒光PCR方法能檢測出50個(gè)病毒拷貝/μL的檢測極限基本一致。另外，本研究建立的熒光PCR方法也表現(xiàn)出良好的特異性，完全可以與經(jīng)典PPV-1和其他豬病病原區(qū)別開，從而為PPV-7的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測提供了有效技術(shù)支撐。

在臨床病料的實(shí)際應(yīng)用中，本方法也表現(xiàn)出了較好的效果，從96份病料中檢測出52份陽性病料，陽性檢出率達(dá)54.2%。這一結(jié)果雖然比孫文超等[12]檢出的71.88%略低，但高于Xing等[4]在豬血清中檢出的32.8%。這些結(jié)果表明我國豬群的PPV-7感染狀況較為嚴(yán)重。另外本研究采集的陽性病料來自山東、江西、廣西等省份，可以看出PPV-7在我國豬群中流行較為廣泛，須引起重視。但是，本研究僅僅是針對(duì)送檢病料進(jìn)行了被動(dòng)監(jiān)測，其檢測結(jié)果的代表性不夠全面，還需要開展更系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查和主動(dòng)監(jiān)測，進(jìn)一步摸清PPV-7在我國豬群的感染和流行規(guī)律。

作為2016年新鑒定和檢測到的一種血清型，PPV-7仍存在致病機(jī)制不清、流行規(guī)律不明，檢測方法匱乏等諸多需要解決的問題。本文建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法有助于PPV-7的早期診斷和發(fā)現(xiàn)，對(duì)于該病原的監(jiān)視和流行趨勢判斷都有重要意義。

4 結(jié)論

本研究以PPV-7全基因組為模板，設(shè)計(jì)合成引物和Taqman探針，建立了PPV-7 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。本方法對(duì)PPV-7具有較好的特異性，對(duì)其它DNA病毒無擴(kuò)增交叉反應(yīng)；其最低檢測極限為45個(gè)病毒拷貝/μL，具有極高的檢測敏感性；3次重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）均小于2%，重復(fù)性較好。因此，本方法可用于PPV-7的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測，對(duì)于該病原的監(jiān)視和流行趨勢判斷具有重要的技術(shù)支撐意義。