石墨烯量子點(diǎn)作為熒光探針定量分析糖果中莧菜紅的含量

金 麗,王 影,劉芳同,張棵實(shí)，張建坡

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

莧菜紅作為一種合成類有機(jī)染料，在中國(guó)被作為食品染料添加劑廣泛用于飲料、糖果、碳酸飲料、口香糖、巧克力和其他食品中[1].但是研究結(jié)果顯示，過量食用莧菜紅會(huì)導(dǎo)致人類生育力顯著下降，并具有致癌、致畸和致突變作用.聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為每日平均食用莧菜紅的量不高于0～1.5 mg/kg[2]，而在中國(guó)認(rèn)為每日平均食用莧菜紅的量不高于0～0.5 mg/kg.因而需要建立可靠的用于定量分析莧菜紅含量的方法.高效液相色譜法[3,4]具有分離效率高和分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，但是需要復(fù)雜的樣品前處理過程，因而不適用于大批量樣品的分析.分光光度法[5]簡(jiǎn)單且可以實(shí)現(xiàn)大批量的分析，但是需要進(jìn)校樣品的預(yù)濃縮.電化學(xué)方法[6,7]由于具有穩(wěn)定性好和靈敏度高的特點(diǎn)而被廣泛研究，但是電極的表面處理有一點(diǎn)費(fèi)時(shí)和復(fù)雜.其它方法，例如薄層色譜[8]和毛細(xì)管電泳[9]，也被用來檢測(cè)莧菜紅，但是需要相對(duì)比較昂貴的儀器、專門的操作人員和復(fù)雜的樣品的前處理等限制了其發(fā)展和在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用.直接熒光分光光度法[10]也被用來定量分析莧菜紅，但是需要復(fù)雜的樣品前處理過程.因此需要探索其他定量分析莧菜紅的分析方法.

基于納米材料的熒光猝滅與猝滅劑之間良好的線性關(guān)系，熒光猝滅定量分析方法受到廣泛關(guān)注[11，12].其中石墨烯量子點(diǎn)作為一種炭材料，具有穩(wěn)定性好、水溶性好、毒性低、生物相容性好和不易光漂白等特點(diǎn)，近年來被廣泛用于熒光傳感器的研究[13-17].而且據(jù)我所知，目前還未見基于石墨烯量子點(diǎn)熒光猝滅定量分析莧菜紅含量的報(bào)道.

本文作為熒光探針石墨烯量子點(diǎn)被成功地用于莧菜紅的定量分析.此方法具有簡(jiǎn)單、快速和成本低的特點(diǎn)，對(duì)保障食品安全和消費(fèi)者權(quán)益具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

莧菜紅、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸鈉和牛血清白蛋白均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.透析袋(保留分子1000 Da)購(gòu)自生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司.所有的試劑均為分析純，使用前未做任何處理.

采用天津港東F-280熒光分光光度計(jì)測(cè)得熒光光譜、采用島津UV-2550紫外可見分光光度計(jì)測(cè)得紫外吸收光譜、熒光照片采用Nikon D7000獲得，通過拉曼檢測(cè)系統(tǒng)獲得拉曼光譜，包括一個(gè)He-Ne光源(20 mW，633 nm，UNIPHASE)，一系列拉曼光譜濾光片(Semrock)和一個(gè)分光光度計(jì)(IHR 320，JY，法國(guó)).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 石墨烯量子點(diǎn)的制備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備了石墨烯量子點(diǎn)[18,19].簡(jiǎn)述為，將2 g的檸檬酸加入到50 mL的燒杯中，200 ℃加熱15 min，直至檸檬酸變?yōu)榱咙S色.之后加入30 mL的10 mg/mL NaOH溶液，超聲1 min，得到黃綠色的石墨烯量子點(diǎn).用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0，透析過夜后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分的水，80 ℃烘干2 h，得到淺黃色晶體，備用.

1.2.2 石墨烯量子點(diǎn)用于定量分析莧菜紅

將10 μL莧菜紅樣品加入到0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)中，定容至2 mL(調(diào)節(jié)pH=5，石墨烯量子點(diǎn)的濃度為0.1 mg/mL)，室溫下孵育5 min后測(cè)熒光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5.0 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯量子點(diǎn)的表征

首先對(duì)石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)校了表征.如圖1b所示，石墨烯量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜為457 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm；圖1b插入圖可見，所合成的石墨烯量子點(diǎn)在365 nm的紫外光激發(fā)下具有明亮的藍(lán)色，而在自然光下為黃綠色.同時(shí)采用室溫拉曼光譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征(如圖1b所示)，可見兩個(gè)D(～1 408 cm-1)和G(～1 640 cm-1)兩個(gè)特征峰.結(jié)果說明成功地制備了石墨烯量子點(diǎn).

Wavelength/nma

Raman Spectra/cm-1b

2.2 石墨烯量子點(diǎn)和莧菜紅之間的相互作用及其反應(yīng)機(jī)理

如圖2所示，當(dāng)將莧菜紅加到石墨烯量子點(diǎn)溶液中時(shí)可以引起石墨烯量子點(diǎn)明顯的降低，7.75 mg/L的莧菜紅溶液可以引起石墨烯量子點(diǎn)83.28%的猝滅率.其反應(yīng)機(jī)理與之前文獻(xiàn)闡述的內(nèi)容相似[20].莧菜紅作為一種有機(jī)染料，每一個(gè)分子均具有-SO3-和-OH基團(tuán)，而石墨烯量子點(diǎn)表面具有羧基和羥基，羥基和磺酸基之間具有較強(qiáng)的相互作用，因而可以形成石墨烯量子點(diǎn)/莧菜紅復(fù)合物.這可以通過紫外吸收光譜加以證明，如圖3所示，隨著咸菜紅濃度的增加，石墨烯量子點(diǎn)的紫外吸收峰(334 nm)會(huì)發(fā)生明顯的藍(lán)移，說明石墨烯量子點(diǎn)和莧菜紅之間形成復(fù)合物.

Wavelength/nm圖2 加入不同濃度莧菜紅后石墨烯量子點(diǎn)的紫外吸收光譜

采用變溫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步討論了反應(yīng)機(jī)理，采用方程F0/F=KLBb[C]+b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，其中F0代表石墨烯量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)代表加入莧菜紅后石墨烯量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，C代表莧菜紅的濃度.如圖3所示，隨著孵育溫度的增加，擬合直線的斜率依次減小，這是因?yàn)殡S著溫度增加，所形成的石墨烯量子點(diǎn)/莧菜紅復(fù)合物的穩(wěn)定性依次減弱.

此外，Kq代表熒光猝滅常數(shù)，可以通過方程Kq=KLB/τ0計(jì)算，τ0代表熒光材料的平均熒光壽命(τ0=6.14 ns).可知Kq為1.8×1012mol·L-1·s-1，該數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2×1010mol·L-1·s-1(最大動(dòng)力學(xué)猝滅常數(shù))[21].結(jié)合紫外吸收光譜可以判定莧菜紅所引起石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低為靜態(tài)猝滅過程.

concentration(mmol·L-1)圖3 不同溫度下莧菜紅濃度和石墨烯量子點(diǎn)熒光變化(F0/F)之間的關(guān)系圖

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和檢出限的確定

研究了pH和孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響.如圖4a所示，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度變化(F0/F)會(huì)隨著pH值的增加而先增大后減小，因而選擇pH等于5；如圖4b所示，當(dāng)孵育5 min后，該體系的熒光強(qiáng)度變化(F0/F)趨于平穩(wěn)，因而選擇孵育時(shí)間為5 min.

pHa

Time/minb圖4 pH和孵育時(shí)間對(duì)石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化(F0/F)的影響

在最優(yōu)條件下，發(fā)現(xiàn)莧菜紅濃度為0.5～3.0 μg/L的范圍內(nèi)，石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低(F0/F)與莧菜紅濃度之間具有良好的線性關(guān)系(如圖5所示)，回歸方程為F0/F=0.50[莧菜紅]+0.94，相關(guān)系數(shù)為0.998.通過方程LOD=(3.3σ/k)計(jì)算了檢出限(LOD)，σ代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，k代表回歸方程的斜率，可知最低檢出限為0.25 μg/L(0.4 nmol/L).通過5次重復(fù)檢測(cè)1.5 μg/L的莧菜紅，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(2.8%)，說明該方法具有良好的重復(fù)性.

Concentrationg of amaranth(μg/L)圖5 莧菜紅濃度對(duì)石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響關(guān)系圖(石墨烯量子點(diǎn)濃度為0.05 mg·L-1，激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm)

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品的檢測(cè)

為了將該熒光猝滅法用于糖果中莧菜紅含量的測(cè)定分析，首先考察了糖果中可能共存物質(zhì)(葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和BSA)和金屬離子(K+和Na+)對(duì)該反應(yīng)體系的影響.如圖6所示，所有物質(zhì)均未引起熒光強(qiáng)度明顯的變化，說明該熒光猝滅方法具有良好的選擇性.

Interfering substances圖6 最優(yōu)條件下不同物質(zhì)對(duì)該猝滅體系的影響

表1 回收率實(shí)驗(yàn)

將該熒光猝滅方法應(yīng)用于定量分析糖果中莧菜紅的含量.檢測(cè)前，將1 g糖果溶解于10 mL水中，之后用磷酸緩沖溶液定容至100 mL(pH=5).采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定樣品中莧菜紅的含量，如表1所示.通過分析可知，糖果樣品中莧菜紅的含量為0.010 67 g/kg，回收率為98.6%～100.3%，說明該熒光猝滅方法可以用于莧菜紅含量的定量分析.

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于石墨烯量子點(diǎn)熒光猝滅定量分析莧菜紅含量的方法.莧菜紅的濃度與石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低之間具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限為0.25 μg/L(0.4 nmol/L).通過紫外吸收光譜、變溫實(shí)驗(yàn)和相關(guān)計(jì)算對(duì)猝滅機(jī)理進(jìn)行了討論，結(jié)果表明此莧菜紅所引起的石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低為靜態(tài)猝滅過程.此外，將該方法用于定量分析糖果中莧菜紅的含量，取得了比較滿意的結(jié)果.與之前檢測(cè)莧菜紅含量的方法相比，該方法簡(jiǎn)單、快速、成本低，是一種快速分析溶液中莧菜紅含量的分析方法.