人參皂苷與遠志皂苷配伍治療大鼠阿爾茨海默病的作用研究

李 卉，張 艷

(1.吉林化工學院 研究生院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

阿爾茨海默病((Alzheimer’s disease，AD)也被稱為老年癡呆病，是一種老年人群中常見的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生在人老年前期和老年期[1].記憶力逐漸減退、認知功能發(fā)生障礙、行為異常和社交障礙等是AD主要臨床的表現(xiàn)[2，3].目前AD的治療藥物主要為西藥，傳統(tǒng)治療AD的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑，通過抑制乙酰膽堿酯酶減緩大腦皮層中樞神經(jīng)釋放乙酰膽堿的降解，從而增加乙酰膽堿的濃度，改善AD病人的認知功能和行為障礙，延緩疾病的發(fā)生，但臨床治療效果不佳，而使其臨床應用受到較大的限制.并且乙酰膽堿酯酶抑制劑僅僅解決了“標”的問題，沒有改變“本”，這些藥物僅能在短時期(6～12個月)內改善AD患者的癥狀(如認知能力)，對患者的日常生活和神經(jīng)精神癥狀(如情感障礙、焦慮、精神變態(tài)等)沒有顯著的改善.

人參，五加科人參屬植物，我國的名貴中藥，在中國、歐洲、東南亞、美洲應用廣泛.《神農本草經(jīng)》記載“人參，味甘微寒，主補五臟(肝、心、脾、肺、腎)，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”[4,5].遠志，遠志科遠志屬植物，主產與我國東北、華北、西北和華中以及四川等地.《神農本草經(jīng)》記載“遠志，味苦辛溫，安神益智，解郁，治驚悸，健忘，夢遺，失眠，咳嗽多痰，癰疽瘡腫”[6,7].人參、遠志在防治健忘癥、老年癡呆等老年性疾病方面歷史悠久，古代治療健忘、癡呆的方劑在組成上以補益藥和安神藥為主，補益以補氣為主，補血、補陰為輔，多用人參，安神以養(yǎng)心安神為主，重鎮(zhèn)安神為輔，常用遠志.將人參與遠志配伍在古方中極為常見，如定志小丸、開心散、人參遠志散等[8,9].這些方劑均以人參、遠志為主藥，因此本文人參、遠志的主要活性成分人參皂苷和遠志皂苷配伍研究其對AD模型大鼠的治療作用，既符合古方今用、中藥現(xiàn)代化的要求，又有望為中藥治療AD的藥理及臨床研究提供科學依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

人參、遠志皂苷購買自吉林大學化學學院.Wistar大鼠，雄性，體重180～220 g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心，許可證號：SCXK(吉)2017-0003．三氯化鋁(AlCl3)(天津市大茂化學試劑廠)；D-半乳糖(上海伊卡生物科技有限公司)；乙酰膽堿酯酶(AchE)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSP-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Morris行為學實驗系統(tǒng)和被動回避性跳臺實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；酶標儀(美國美谷分子有限公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 AD模型的建立、分組及給藥

1.2.2 Morris水迷宮實驗

實驗前24 h，將大鼠放入水迷宮中，自由游泳120 s熟悉環(huán)境，并將其引導站上平臺10 s，次日進行訓練.參考文獻方法[10-12]，實驗時將平臺藏匿于水面下1 cm，水溫保持在25 ℃左右.將水迷宮等距離設東、南、西和北4個標記點，作為大鼠進入水池的入水點，將水面等分為4個象限，并將平臺設置于第三象限的中間.Morris水迷宮實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗.定位航行實驗時將大鼠從某一特定象限面向池壁放入水中，記錄120 s內大鼠尋找平臺的軌跡圖、逃避潛伏期.若大鼠120 s內未能成功找到平臺，引導其站上平臺并停留10 s.空間探索實驗于定位航行實驗結束后24 h進行，撤除平臺，重復試驗，記錄120 s內大鼠的運動軌跡、穿越平臺位置的次數(shù)、在該象限滯留的時間和路程，用來反映大鼠空間探索的記憶能力.

1.2.3 大鼠被動回避性跳臺實驗

跳臺箱底鋪有鐵柵作為刺激電極，內有橡皮墊，作為大鼠回避電刺激的安全平臺.將大鼠放入適應5 min，隨后通入36 V交流電，大鼠遭到電刺激后跳上安全平臺，若從臺上跳下，接觸鐵柵為錯誤反應，記錄2 min內出現(xiàn)的錯誤次數(shù)，24 h后重新實驗，以記錄的潛伏期和出現(xiàn)的錯誤反應次數(shù)來判斷大鼠的學習和記憶能力.

1.2.4 測定指標

行為學實驗結束后，立即處死大鼠，斷頭取血，分離血清，取腦，制備成10%的腦勻漿.分別按試劑盒方法[13,14]測定大鼠血清和腦勻漿中AchE、CAT、SOD、GSH-Px活性及MDA含量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

2 結果與討論

2.1 大鼠一般情況的觀察

與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡，毛色黃且無光澤，活動遲緩，進食減少；與模型組大鼠比較，治療組大鼠精神狀態(tài)好轉，毛色較有光澤，食欲和體重增加，活動較為靈活.

2.2 對AD大鼠空間認知能力的影響

記憶力逐漸減退、認知功能發(fā)生障礙、行為異常和社交障礙等是阿爾茨海默病主要臨床的表現(xiàn).本文采用Morris水迷宮實驗評價AD大鼠的空間認知能力.由圖1可以看出，空白組大鼠很快就可以找到水下平臺，而模型組大鼠主要在外圍活動，活動區(qū)域在各象限分布無顯著差異，表明模型組大鼠產生了嚴重的空間分辨性障礙.治療組大鼠也可以很快找到水下平臺，活動范圍較模型組相比顯著縮小.與空白組比較，模型組大鼠5 d內潛伏期內均升高(P<0.05或P<0.01)，平均潛伏期升高.與模型組比較，治療組大鼠5 d內潛伏期內均降低(P<0.05)，平均潛伏期降低(P<0.05)，見表1.由圖2和表2可以看出，空白組大鼠在平臺所在象限出現(xiàn)的頻率較多，而模型組大鼠依然主要在外圍活動，進入有效區(qū)域的運動時間、運動距離及次數(shù)均減少(P<0.05).與模型組比較，治療組大鼠在第三象限出現(xiàn)的頻率較高，進入有效區(qū)域的運動時間、運動距離及次數(shù)均增加(P<0.05).以上結果表明，經(jīng)人參皂苷和遠志皂苷配伍可以明顯改善AD大鼠嚴重的空間分辨性障礙，恢復空間認知能力.

圖1 定位巡航實驗軌跡圖

表1 人參皂苷和遠志皂苷配伍對AD大鼠定位巡航實驗潛伏期的影響

注：與空白組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05.

圖2 空間搜索實驗軌跡圖

表2 人參皂苷和遠志皂苷配伍對AD大鼠空間搜索實驗的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

2.3 對AD大鼠被動回避反應能力的影響

采用被動回避性跳臺實驗的逃逸潛伏期、錯誤次數(shù)，24錯誤次數(shù)三項指標反應AD大鼠被動回避反應能力，評價大鼠的記憶獲得和鞏固能力.如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠逃逸潛伏期明顯延長、跳臺錯誤次數(shù)、24錯誤次數(shù)明顯均增加(P<0.05)，表明模型組大鼠記憶獲得和記憶鞏固能力出現(xiàn)了障礙,被動回避反應能力下降.與模型組比較，治療組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短、跳臺錯誤次數(shù)、24錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)，表明經(jīng)人參皂苷和遠志皂苷配伍治療后，記憶獲得和記憶鞏固能力有較好的恢復，能夠改善AD大鼠的被動回避反應能力.

表3 人參皂苷和遠志皂苷配伍對AD大鼠記憶獲得和記憶鞏固障礙的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

2.4 對AD大鼠AchE的影響

乙酰膽堿(Ach)是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質之一，其主要的功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起著十分重要的作用，并且也特定行為學反應和認知活動之間有一定聯(lián)系.研究發(fā)現(xiàn)，當機體需要對新刺激進行分析時，在學習和記憶、自發(fā)運動、空間工作記憶、注意、和探究行為等認知活動中，基底前腦內的膽堿能神經(jīng)元Ach會被激活.AchE是水解Ach重要的酶，腦內細胞外AchE發(fā)生變化，主要反映在膽堿能神經(jīng)元的活動差異.人的腦組織內含有大的量AchE，但AchE的活性會隨著年齡的增長而升高，因此，AchE含量的測定對AD的治療十分必要.如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠血清、腦組織中AChE活力顯著升高(P<0.05)，治療組AchE活力相比于模型組活性明顯降低并接近空白組(P<0.05)，表明人參皂苷與遠皂苷志配伍可以通過抑制Ach活性，減少Ach水解來改善AD癥狀.

表4 人參皂苷和遠志皂苷配伍對AD大鼠AchE活性的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

2.5 對AD大鼠抗氧化指標的影響

研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中存在氧化-還原失衡狀況，即自由基產生增加清除減少.SOD是一種源于生命體的活性物質，生物體內清除自由基的首要物質，是衰老與死亡的直觀指標.GSH-Px可通過清除·OH等活性氧，減少脂類過氧化，緩解生物膜損傷.脂質過氧化也是細胞老化的原因之一，預防脂類過氧化可延緩細胞老化，所以GSH-Px在預防衰老方面起到重要作用.CAT可催化合成膽堿能神經(jīng)中的重要遞質Ach.研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中CAT活性降低，AchE活性升高，Ach含量明顯降低，因而CAT水平與記憶能力密不可分.MDA是細胞膜脂質氧化最重要的產物之一，它的產生還還能加劇膜的損傷，因此可通過MDA了水平反應細胞膜脂質過氧化的程度.如表5、表6所示，與空白組比較，模型組大鼠血清和腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性均降低，MDA含量均顯著升高(P<0.05).與模型組比較，治療組大鼠血清、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性均升高，MDA含量均顯著降低(P<0.05)，表明人參皂苷和遠志皂苷配伍可明顯增強AD大鼠的抗氧化能力.

表5 人參遠志配伍對阿爾茨海默病大鼠血清中抗氧化指標的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

表6 人參遠志配伍對阿爾茨海默病大鼠腦組織中抗氧化指標的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

3 結 論

人參皂苷和遠志皂苷配伍可以有效提升AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導的AD模型大鼠的空間認知能力、記憶獲得和記憶鞏固能力，具有治療AD的作用.其治療AD作用與降低AchE活性和對抗自由基對細胞的損傷引起的氧化損傷有關.