成纖維細(xì)胞生長因子21抑制脂肪細(xì)胞中網(wǎng)膜素表達(dá)

陳 鏑，趙妍妍，梁向艷，魏蘭蘭，謝 榮，劉英光，馬鳴嘯，趙玉峰

(西安醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 陜西 西安 710021)

成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，可降低血糖、改善脂代謝和減輕體質(zhì)量。注射FGF21還可導(dǎo)致小鼠骨密度降低[1]。網(wǎng)膜素(omentin)是近來發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，參與調(diào)節(jié)糖代謝，并影響心血管和骨組織的功能。網(wǎng)膜素水平與骨密度呈正相關(guān)，可減輕雌激素缺乏所致的骨密度減小，表明網(wǎng)膜素參與骨代謝的調(diào)控[2]。FGF21通過下調(diào)脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素(adiponectin)表達(dá)而改善肥胖相關(guān)的糖脂代謝異常，提示FGF21通過調(diào)控脂肪因子表達(dá)來影響機(jī)體代謝。本研究檢測了FGF21對3T3-F442A脂肪細(xì)胞的作用，可通過它的受體激活ERK1/2，進(jìn)而抑制網(wǎng)膜素的基因表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料:3T3-F442A細(xì)胞系(歐洲細(xì)胞保藏中心);FGF21(Peprotech公司)；胰島素、地塞米松、 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和羅格列酮(Sigma-Aldrich公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Invitrogen公司)；Real-time PCR檢測用試劑(TaKaRa公司)；Western blot抗體(Cell Signaling公司);AZD4547、U0126(MCE公司)。

1.2 方法

1.2.1 3T3-F422A細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：3T3-F422A細(xì)胞增殖至接觸抑制2 d后，換至誘導(dǎo)分化液(DMEM+10% FBS+0.24 IU/mL胰島素+2 μg/mL地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+50 μmol/L羅格列酮)培養(yǎng)2 d，隨后換至維持液(DMEM+10% FBS+0.24 IU/mL胰島素)培養(yǎng)2 d，之后換至完全培養(yǎng)液中(DMEM+10% FBS)培養(yǎng)6～8 d，當(dāng)80%以上細(xì)胞出現(xiàn)脂滴時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Real-time PCR檢測網(wǎng)膜素mRNA表達(dá)：提取3T3-F422A細(xì)胞的總RNA，測定總RNA濃度和純度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，real-time PCR擴(kuò)增。小鼠網(wǎng)膜素引物序列，上游引物：5′-TGCTACCAGAGGTTGCAGTG-3′，下游引物：5′-CTTGTGC CTTTGTGTGCTCC-3′。小鼠β-actin引物序列，上游引物：5′-CGTTGGCATCCACGAAACTA-3′，下游引物：5′-AGTACTTG CGCTCAGGAGGA-3′。反應(yīng)體系20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、1 μL 上游引物、1 μL下游引物、2 μL cDNA、6 μL RNase-free ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法對基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.3 Western blot檢測pERK1/2蛋白表達(dá)：提取3T3-F422A細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育。漂洗后室溫孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗1 h。漂洗后使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系統(tǒng)曝光檢測，以β-actin作為內(nèi)參，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 FGF21和FGFR抑制劑對ERK1/2磷酸化的影響:FGF21使ERK1/2的磷酸化水平較對照組顯著升高(P<0.05)。FGFR抑制劑AZD4547可顯著回降FGF21對ERK1/2磷酸化水平的上調(diào)作用(P<0.05)(圖1)。

2.2 FGFR和ERK1/2抑制劑對FGF21調(diào)控網(wǎng)膜素基因表達(dá)的影響:FGF21使網(wǎng)膜素基因表達(dá)較對照組顯著下降(P<0.05)。FGFR抑制劑AZD4547和ERK1/2抑制劑U0126均可顯著回升FGF21對網(wǎng)膜素基因表達(dá)的下調(diào)作用(P<0.05)(表1)。

3 討論

網(wǎng)膜素參與骨代謝，其血漿水平與骨密度呈正相關(guān)。而FGF21易導(dǎo)致骨密度的下降，其機(jī)制尚不明確[3]。

本研究表明， FGF21可下調(diào)3T3-F422A脂肪細(xì)胞中網(wǎng)膜素的基因表達(dá)。FGF21結(jié)合FGFR后可激活脂肪細(xì)胞內(nèi)信號分子ERK1/2。FGF21可使脂肪細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化水平顯著增強(qiáng)，而ERK1/2抑制劑可回降FGF21上調(diào)ERK1/2的磷酸化作用，從而證實(shí)FGF21在脂肪細(xì)胞中激活ERK1/2信號分子通路。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with FGF21圖1 FGF21和FGFR抑制劑對ERK1/2磷酸化的影響Fig 1 Effect of FGF21 and FGFR inhibitor on ERK1/2

groupomentincontrol 1.00±0.16FGF21 0.62±0.10*AZD4547+FGF21 0.82±0.05#U0126+FGF21 0.81±0.12#

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with FGF21.

綜上所述，F(xiàn)GF21通過FGFR-ERK1/2信號通路調(diào)控脂肪細(xì)胞中網(wǎng)膜素表達(dá)，本結(jié)果有助于進(jìn)一步揭示網(wǎng)膜素表達(dá)抑制在FGF21影響機(jī)體代謝，尤其是骨代謝中的作用。