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    內皮間質轉化參與阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化

    2018-09-05 12:00:14鄧飛艷謝路遠詹世斌劉志燕高妮娜盛小伍
    基礎醫(yī)學與臨床 2018年9期
    關鍵詞:阿霉素內皮內皮細胞

    鄧飛艷,謝路遠,詹世斌,劉志燕,薛 蕾,高妮娜,盛小伍*

    (1.湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院 中心實驗室,湖南 長沙 410000; 2.南華大學, 湖南 衡陽 421001)

    阿霉素(doxorubicin,Dox)是使用最廣泛的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物,療效顯著,但因具有嚴重心臟毒性,臨床應用受限[1-2]。阿霉素與心肌組織親和力較高,引起心肌細胞內氧自由基產(chǎn)生增多、清除減少及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎性因子的產(chǎn)生增多[1],導致心肌細胞凋亡和壞死[2-4],最終心肌細胞被纖維組織取代[5],形成以肌成纖維細胞增多為特點的心肌纖維化[6]。最近研究表明內皮間質轉化(endothelial mesenchymal transition,EMT)是肌成纖維細胞的重要來源[7-8]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是重要的促纖維化因子,在纖維化疾病中產(chǎn)生增加,可誘導EMT生成肌成纖維細胞[6-9]。目前阿霉素心肌纖維化機制仍未闡明。本實驗旨在研究EMT在阿霉素心肌纖維化形成中的作用,為阿霉素心臟病的防治提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物:SPF級SD大鼠,雌雄各24只,質量(220±20)g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,質量合格證編號:43004700030496)。

    1.1.2 主要試劑:注射用鹽酸多柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司);Masson試劑盒(BASO公司);HE染色試劑盒(北京索萊寶生物科技公司);α-SMA抗體和vWF抗體(Abcam公司);Trizol、反轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠分組及處理:將大鼠隨機分成對照組和阿霉素1、2、6周3組(DOX-1、2和6周),每組12只,雌雄各半。實驗前適應飼養(yǎng)1周,觀察大鼠的活動、進食及大小便情況,確保大鼠健康狀態(tài)良好。對照組(每周腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL/kg,每周1次,連續(xù)6周)。阿霉素組(每周腹腔注射阿霉素2 mg/kg[10],每周1次,連續(xù)6周)。分別于1、2和6周處死大鼠,檢測心肌纖維化相關指標及心肌組織血管內皮間質轉化指標。

    1.2.2 HE染色和Masson三色染色檢測心肌組織病理形態(tài)學改變:按說明書操作。

    1.2.3 RT-qPCR檢測纖維化相關基因Col1α、Col3α、TGF-β1 mRNA表達:應用NCBI Primer-Blast設計引物。提取大鼠心肌組織RNA,并測定其含量。反轉錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH作為內參,檢測纖維化相關基因Col1α、Col3α和TGF-β1 mRNA的表達水平。引物序列(表1)。

    1.2.4 免疫組織化學法檢測心肌組織TGF-β1表達:采用EnVision兩步法對心肌組織進行免疫組織化學染色。以4%中性甲醛液固定心肌組織,石蠟包埋,4 μm厚度切片。以TGF-β1抗體作為一抗,滴加一抗后室溫孵育1 h,之后用EnVision兩步法試劑盒室溫孵育40 min,最后用DAB顯色劑顯色5 min,蘇木素復染細胞核,脫水、透明、封片。

    1.2.5 免疫熒光染色檢測心肌組織EMT現(xiàn)象:所有心肌組織均以4%中性甲醛液固定,石蠟包埋,4 μm厚度切片。免疫熒光雙染,同時孵兩種一抗(兔抗vWF、鼠抗α-SMA),4 ℃過夜后沖洗3遍。隨后37 ℃孵育兩種二抗(羊抗兔 Alexa、羊抗鼠Alexa),DAPI復染細胞核,封片熒光顯微鏡下觀察。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結果

    2.1 大鼠一般情況

    腹腔注射阿霉素后,約1/3的大鼠因急性心律失常死亡。所有大鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀少,腹部膨隆,精神不好,活動差。1和2周組大鼠心包積液,6周組大鼠心包積液、腹腔積液明顯。

    表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

    2.2 阿霉素對心肌形態(tài)學的影響

    阿霉素6周組大鼠心腔明顯擴大、心室壁變薄(圖1A)。心肌纖維排列紊亂,心肌間隙明顯增寬,心肌纖維溶解和壞死(圖1B紅色箭頭所示),心肌細胞間隙有中性粒細胞及單核、淋巴細胞浸潤(圖1B黃色箭頭所示),血管周圍有大量纖維組織圍繞(圖1B藍色箭頭所示)。

    A.HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis under naked eyes; B.HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis under microscope

    圖1阿霉素誘導心肌纖維化形態(tài)
    Fig1Morphologyofdoxorubicin-inducedmyocardialfibrosis

    2.3 阿霉素對心肌間質及血管周圍膠原面積的影響

    阿霉素1、2、6周組血管周圍和心肌間質中膠原纖維組織增多,血管內皮排列不規(guī)則,血管內紅細胞減少(圖2A)。阿霉素1周組大鼠心肌間質及血管周圍膠原面積高于對照組(P<0.05),阿霉素2和6周組大鼠心肌間質及血管周圍膠原面積顯著高于對照組(P<0.01)(圖2B)。

    2.4 阿霉素對心肌Col1α、Col3α和TGF-β1 mRNA表達的影響

    細胞外基質的過量產(chǎn)生和沉積是心肌纖維化的主要特點。纖維化組織中膠原纖維的主要成分為I型膠原和III型膠原。阿霉素2和6周組大鼠心肌組織Col1αmRNA的表達高于對照組(P<0.05)(圖3A)。阿霉素2和6周組大鼠心肌組織Col3αmRNA的表達高于對照組(P<0.05)(圖3B)。阿霉素6周組大鼠心肌組織TGF-β1 mRNA的表達高于對照組(P<0.05)(圖4A)。

    2.5 阿霉素對心肌TGF-β1蛋白表達的影響

    TGF-β1陽性表達呈棕黃色顆粒狀,位于細胞質中。對照組大鼠心肌組織TGF-β1表達很少(圖4B,阿霉素1周組表達較少(圖4C),阿霉素2周組表達較多(圖4D),阿霉素6周組表達明顯增多(圖4E)。

    2.6 阿霉素對心肌EMT的影響

    對照組心肌組織中未見vWF和α-SMA共染的現(xiàn)象,阿霉素1、2和6周組心肌組織中可見明顯vWF和α-SMA共染的現(xiàn)象(圖5)。

    3 討論

    阿霉素心臟毒性以不可逆轉的心肌病和充血性心力衰竭為主, 其心肌病理改變復雜。既往研究表明阿霉素介導的心臟病患者以擴張型心肌病為主,而青少年阿霉素毒性患者常伴有限制型心肌病[11]。本研究發(fā)現(xiàn)成年SD大鼠腹腔注射阿霉素后心臟出現(xiàn)心室腔明顯擴大、心室壁變薄等擴張型心肌病的表現(xiàn)。隨著阿霉素劑量的累積,心肌纖維化面積增加,而心肌纖維化可以導致心臟變硬,心力衰竭患者常伴有心肌纖維化,提示改善心肌纖維化有益于阿霉素心臟病的治療。在阿霉素心肌纖維化模型中發(fā)現(xiàn),心肌血管周圍圍繞大量纖維組織,并且血管內皮細胞損傷,血管通透性增加。血管內皮轉化可能參與阿霉素心肌纖維化形成的機制。在纖維化疾病中,靜息狀態(tài)的成纖維細胞激活和增殖被認為是成肌纖維細胞的主要來源。EMT自從被提出也是成肌纖維細胞的來源之后,一系列的動物模型和人體纖維化疾病研究表明EMT參與心臟、肺、腎臟和放射性纖維化疾病的形成[6,12-13]。

    A.Masson trichrome staining for fibrosis collagen in cardiac cross sectional parts; B.the ratio of fibrotic area to cardiac gross area of each Masson trichrome staing image in each group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

    A.Col1α mRNA expression level; B.Col3α mRNA expression level; *P<0.05 compared with control group圖3 阿霉素誘導心肌纖維化相關基因的表達Fig 3 Doxorubicin-induced cardiac fibrosis-related gene

    A.TGF-β1 mRNA expression level;B.TGF-β1 protein expression level in control group;C.TGF-β1 protein expression level in Dox-1 week group;D.TGF-β1 protein expression level in Dox-2 weeks group;E.TGF-β1 protein expression level in Dox-6 weeks group;*P<0.05 compared with control group

    Immunostaining of cardiac tissue in control and doxorubicin 1,2 and 6 weeks groups, red part indicated vWF staining positive, green part indicated α-SMA staining positive; the green arrow showed yellow part which means vWF and α-SMA coexpression and positive

    圖5阿霉素誘導了心肌纖維化中EMT的形成
    Fig5DoxorubicininducedtheformationofEMTinmyocardialfibrosis(×100,×400)

    本研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射阿霉素后,許多血管內皮細胞表達內皮細胞標志vWF的同時也表達間質標志α-SMA,而對照組大鼠心肌血管內皮細胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。血管內皮細胞同時表達vWF和α-SMA說明血管內皮細胞正在向間質細胞轉化。本研究證實血管內皮通過EMT參與阿霉素心肌纖維化的形成,抑制內皮間質轉化可能成為阿霉素心臟病的治療靶點。

    綜上所述,阿霉素可誘導大鼠不可逆的心肌纖維化,內皮間質轉化可能參與阿霉素所致的心肌纖維化的形成。

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