尿素、尿酸和總蛋白復(fù)合冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

于 婷， 沈 敏， 孫 楠， 曲守方， 黃 杰

（1. 中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2. 美康生物科技股份有限公司參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104）

血清中的尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，是反映腎臟功能的重要指標(biāo)之一[1-2]，并且與冠狀動脈粥樣硬化程度相關(guān)。其測定方法包括參考方法如同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法，以及常規(guī)方法如脲酶法、化學(xué)方法、電極法和干化學(xué)法等[3]。血清中的尿酸含量可充分反映人體內(nèi)代謝、免疫等機(jī)能的狀況，是診斷痛風(fēng)、尿毒癥、糖尿病等多種疾病的重要指標(biāo)之一[4-6]。其測定方法包括參考方法如同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法、同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法[7]，以及常規(guī)方法如磷鎢酸還原法、尿酸酶-過氧化物酶偶聯(lián)法等。血清總蛋白可作為肝臟合成反應(yīng)功能的重要指標(biāo)之一[8]，對了解機(jī)體的營養(yǎng)狀況及肝臟疾病的診斷、監(jiān)測及治療均有著重要的意義。其測定方法包括參考方法以及常規(guī)方法如雙縮脲終點(diǎn)法和雙縮脲速率法等[9-10]。

目前，臨床上使用的尿素、尿酸、總蛋白檢測試劑盒生產(chǎn)廠商很多，然而各廠商的校準(zhǔn)品在基質(zhì)選擇[11-12]、制備方法、量值溯源等方面都存在著一定差異，因此造成同一項目檢測結(jié)果可比性差的狀況。為了保證測量結(jié)果在時間和空間上的準(zhǔn)確性和可比性，研制基質(zhì)效應(yīng)小、互通性良好、采用參考方法定值的標(biāo)準(zhǔn)品勢在必行。本研究研制了以冰凍人血清為基質(zhì)的尿素、尿酸和總蛋白復(fù)合冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 78-1磁力攪拌器（常州國華公司）；2XZ-1旋片式真空泵（臨海譚氏真空設(shè)備公司）；XS205DU電子天平，量程范圍為81 g/220 g（瑞士梅特勒公司）；Cary 100紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；7180全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.1.2 互通性驗(yàn)證用試劑 血清尿素檢測試劑盒：批號16081101，寧波美康生物公司；批號154178-01，瑞士羅氏公司；批號16-0801，北京九強(qiáng)公司。血清尿酸檢測試劑盒：批號16072901，寧波美康生物公司；批號148668-01，瑞士羅氏公司；批號16-0902，北京九強(qiáng)公司?？偟鞍讬z測試劑盒：批號16081502，寧波美康公司；批號k250，瑞士羅氏公司；批號16-0713，北京九強(qiáng)公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 尿素國際標(biāo)準(zhǔn)品（批號SRM912a）、尿酸國際標(biāo)準(zhǔn)品（批號SRM913a）、總蛋白國際標(biāo)準(zhǔn)品（批號SRM927e）均購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 收集寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所外觀清澈透明，無溶血、黃疸、乳糜的臨床混合血清，進(jìn)行人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和梅毒檢測，取上述檢測結(jié)果為陰性的血清樣本合并混勻后，進(jìn)行初濾、0.45 μm濾膜過濾、0.22 μm濾膜過濾。過濾裝置經(jīng)高壓滅菌，并在生物安全柜中分裝于凍存管內(nèi)，0.5 mL/支，于-70 ℃保存。

1.2.2 均勻性檢驗(yàn) 參照CNAS-GL03《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》。在分裝的初始、中間及最終階段各抽取28支進(jìn)行均勻性分析。采用精密度良好的7180全自動生化分析儀對抽取樣本進(jìn)行測定，每個樣本測定3次并進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在3個溫度下進(jìn)行。在第1、11、18、25、30、33、35、36、37天各取出9支樣本，分別在20～25 ℃、2～8 ℃、-20 ℃下存放3支，作為第37、27、20、13、8、5、3、2、1天的樣本，在同一天內(nèi)將所有的樣本進(jìn)行統(tǒng)一測定。采用寧波美康生物公司的總蛋白測定試劑盒（雙縮脲法）、尿素氮測定試劑盒（脲酶-谷氨酸脫氫酶法）和尿酸測定試劑盒（尿酸酶法），采用7180全自動生化分析儀對樣本進(jìn)行測定。每個樣本測定3次。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，利用線性回歸方差分析表來評估回歸的顯著性。-70 ℃為候選品的保存條件，進(jìn)行長期穩(wěn)定性的觀察，通過期間核查確認(rèn)。

1.2.4 定值 采用參考方法或者經(jīng)確認(rèn)的方法和相應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)品定值，選擇3～4家具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，具體方法見表1。定值結(jié)果采用“靶值±不確定度”表示。不確定度評估以測量不確定度表示指南（Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）為基礎(chǔ)，根據(jù)GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作原則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[13]進(jìn)行不確定度評估。不確定度的來源包括3部分，分別為：定值、均勻性以及穩(wěn)定性引入的不確定度。

表1 各實(shí)驗(yàn)室采用的賦值方法

1.2.5 互通性評估 依據(jù)WS/T 356—2011《基質(zhì)效應(yīng)與互通性評估指南》[14]進(jìn)行互通性評估。評估方式：用2種測定方法（參考方法或經(jīng)確認(rèn)的方法、常規(guī)方法）同時對選定的25份新鮮臨床血清樣本（各濃度分布均勻）和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，建立2種方法測定臨床血清樣本的結(jié)果數(shù)學(xué)關(guān)系（回歸）。以評估方法測定值為Y軸，以比對方法測定值為X軸，用Origin 8.0軟件繪制散點(diǎn)圖及95%可信區(qū)間。采用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，采用線性回歸模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

采用單因素方差分析方法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。尿素、尿酸和總蛋白的F值分別為1.071 4、1.339 9和1.275 0，均＜F0.05。

表2 候選品均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合冰凍人血清生化國家標(biāo)準(zhǔn)品在-20 ℃條件下，尿素、尿酸和總蛋白均至少可穩(wěn)定37 d；在2～8 ℃條件下，尿素可穩(wěn)定27 d，尿酸及總蛋白至少可穩(wěn)定37 d；在20～25 ℃條件下，尿素僅能穩(wěn)定3 d，尿酸可穩(wěn)定8 d，總蛋白可穩(wěn)定27 d。因該國家標(biāo)準(zhǔn)品計劃保存條件為-70 ℃，故結(jié)果符合要求。在-70 ℃條件下，12個月穩(wěn)定性良好，并將持續(xù)觀察長期穩(wěn)定性。見表3、表4。

2.3 定值

各實(shí)驗(yàn)室賦值結(jié)果變異系數(shù)均＜3.0%。見表5。

2.4 不確定度評估（以尿素為例）

2.4.1 定值結(jié)果引起的不確定度分析 候選品中尿素定值的不確定度（uchar）計算公式為：

式中s為各實(shí)驗(yàn)室總的標(biāo)準(zhǔn)偏差，p為實(shí)驗(yàn)室總數(shù)。計算出尿素定值的不確定度為0.08 mmol/L。

2.4.2 均勻性引入的不確定度 采用單因素方差分析方法時，均勻性的不確定度（ubb）計算公式為：

式中n0為（有效）（子）組單元數(shù)。計算出尿素均勻性的不確定度為0.02 mmol/L。

2.4.3 穩(wěn)定性引入的不確定度 穩(wěn)定性引入的不確定度（us）的計算公式為：

式中s（b1）為與斜率相關(guān)的不確定度，X為標(biāo)準(zhǔn)品有效期。計算出尿素穩(wěn)定性的不確定度為0.022 57 mmol/L。

尿酸和總蛋白的不確定度分析同尿素。尿酸的不確定度為1.98 μmol/L，總蛋白的不確定度為1.73 g/L。

經(jīng)聯(lián)合賦值及不確定度評估，每支復(fù)合冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的特性值分別為：尿素（5.68±0.17）mmol/L（k=2），尿酸（288.68±3.96）μmol/L（k=2），總蛋白（67.03±3.46）g/L（k=2）。

2.5 互通性評估（以尿素為例）

對參考方法和3個不同檢測系統(tǒng)進(jìn)行25份血清樣本的直線相關(guān)與回歸分析，以參考方法測定值為X軸（對照），待評方法測定值為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析，候選品中尿素濃度均在回歸直線95%可信區(qū)間范圍內(nèi)，見圖1。按照同樣方法分析候選品中的尿酸和總蛋白，其在3個檢測系統(tǒng)上均無基質(zhì)效應(yīng)。

表3 短期穩(wěn)定性測定結(jié)果

表4 12個月穩(wěn)定性測定結(jié)果

表5 各實(shí)驗(yàn)室賦值結(jié)果匯總

圖1 尿素候選品在3個檢測系統(tǒng)上的基質(zhì)效應(yīng)評價

3 討論

體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品是實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確一致的重要組成部分，也是保證量值有效傳遞的計量實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)。均勻性、穩(wěn)定性和定值準(zhǔn)確是標(biāo)準(zhǔn)品的主要特征?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)，理論上標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量采用與實(shí)際樣本相同的物質(zhì)作為基質(zhì)。因此本實(shí)驗(yàn)室研制的這批尿素、尿酸和總蛋白復(fù)合國家標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)為人源血清，且未添加任何抗菌藥物和防腐劑，通過濾膜過濾保證無菌。常規(guī)方法在生化分析儀上檢測尿素、尿酸和總蛋白復(fù)合國家標(biāo)準(zhǔn)品精密度良好、自動化程度高，適宜在短時間內(nèi)同時檢測大量樣本，所以本研究采用常規(guī)方法進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示尿素、尿酸和總蛋白復(fù)合冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品均勻性良好。在穩(wěn)定性方面，要考慮長期穩(wěn)定性（有效期）和短期穩(wěn)定性，其中短期穩(wěn)定性本研究考察了3個不同溫度：-20 ℃、2～8 ℃和20～25 ℃。短期穩(wěn)定性與候選品運(yùn)輸、使用過程等外部因素有關(guān)。長期穩(wěn)定性與-70 ℃貯存條件下血清尿素、尿酸和總蛋白的變化有關(guān)。血清成分在-70 ℃貯存條件下穩(wěn)定性可以持續(xù)2～7年。因時間所限，本批標(biāo)準(zhǔn)品長期穩(wěn)定性觀察時間僅進(jìn)行到12個月，以后將開展期間核查，持續(xù)觀察。根據(jù)文獻(xiàn)[15]和我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法參考方法或WS/T 345—2011血清尿素方法為尿素標(biāo)準(zhǔn)品賦值，采用同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法、同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法參考方法或血清尿酸酶法為尿酸標(biāo)準(zhǔn)品賦值，采用YY/T 1195—2011血清總蛋白測定參考方法為總蛋白標(biāo)準(zhǔn)品賦值。測量前均對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)、驗(yàn)證和維護(hù)，以確定最佳工作條件，結(jié)果令人滿意。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室研制的尿素、尿酸和總蛋白復(fù)合冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品，穩(wěn)定性、均勻性、互通性良好，定值結(jié)果準(zhǔn)確。這批標(biāo)準(zhǔn)品將主要應(yīng)用于尿素、尿酸和總蛋白常規(guī)方法的校準(zhǔn)和評價，從而促進(jìn)檢測結(jié)果的互認(rèn)，保障對尿素、尿酸和總蛋白體外診斷試劑的監(jiān)管。