新城疫病毒M蛋白細(xì)胞核定位的機(jī)制與功能研究進(jìn)展

段志強(qiáng)，謝玲玲，周 迪，王燕碧，趙采芹，唐 宏

(1. 貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025； 3貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴陽(yáng) 550018)

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)屬于單負(fù)鏈病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒亞科(Avulavirinae)、正禽腮腺炎病毒屬(Orthoavulavirus)成員，是一種嚴(yán)重危害世界家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原之一[1-2]。NDV含有一條單股負(fù)鏈不分節(jié)段的基因組RNA，其基因組結(jié)構(gòu)為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，可編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(P基因經(jīng)過(guò)RNA編輯產(chǎn)生的V蛋白和W蛋白)[3]。與其他副黏病毒M蛋白一樣，NDV M蛋白同樣位于病毒囊膜內(nèi)表面，構(gòu)成病毒囊膜和核衣殼連接的支架，在病毒粒子的組裝和出芽過(guò)程中發(fā)揮核心作用[4-5]。雖然NDV主要在細(xì)胞質(zhì)中完成病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成以及病毒的組裝，但是其基因組編碼的M蛋白和W蛋白卻能在病毒感染早期通過(guò)自身攜帶的核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS)進(jìn)入細(xì)胞核[6-7]。近年來(lái)，研究人員分別對(duì)M蛋白和W蛋白NLS關(guān)鍵堿性氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLS突變均導(dǎo)致兩個(gè)蛋白由細(xì)胞核定位變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)定位，但是M蛋白NLS突變顯著降低了病毒的復(fù)制和致病性[8]，而W蛋白NLS突變卻不影響病毒的復(fù)制和致病性[7]，暗示了M蛋白細(xì)胞核定位的重要性。此外，基于水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)、人呼吸道合胞體病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)和麻疹病毒(measles virus, MeV)M蛋白細(xì)胞核定位的功能研究結(jié)果[9-11]，研究人員推測(cè)NDV M蛋白的細(xì)胞核定位有利于細(xì)胞質(zhì)中病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并且可能會(huì)抑制細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。鑒于M蛋白在NDV生活周期中的重要作用，本文結(jié)合課題組近些年對(duì)M蛋白細(xì)胞核定位的相關(guān)研究，主要從NDV M蛋白的細(xì)胞定位特征、M蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制和功能方面進(jìn)行綜述，以期為NDV M蛋白細(xì)胞核定位的相關(guān)功能研究提供參考。

1 NDV M蛋白細(xì)胞定位特征

早在1988年Faaberg等[12]用M蛋白單克隆抗體檢測(cè)NDV感染細(xì)胞后的M蛋白分布，發(fā)現(xiàn)M蛋白能夠定位在細(xì)胞核中。由于當(dāng)時(shí)的觀點(diǎn)認(rèn)為副黏病毒主要在細(xì)胞質(zhì)中完成其生活史，病毒蛋白沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞核的必要，所以M蛋白可能只是積聚在細(xì)胞核膜表面，而不是進(jìn)入了細(xì)胞核。為了進(jìn)一步研究M蛋白的細(xì)胞定位，使用不同濃度的表面活性劑處理細(xì)胞，還是發(fā)現(xiàn)M蛋白能夠定位在細(xì)胞核[13]。隨后有研究證實(shí)，在沒(méi)有其他病毒蛋白存在的情況下，質(zhì)粒單獨(dú)表達(dá)的M蛋白同樣聚集在細(xì)胞核中，并且還能定位在核仁[14]，由此確證了NDV M蛋白的細(xì)胞核定位特征。因?yàn)镹DV子代病毒粒子的組裝和出芽需要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜進(jìn)行，并且需要M蛋白的參與，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在NDV感染后期M蛋白由細(xì)胞核進(jìn)入了細(xì)胞質(zhì)[14-15]，因此，證實(shí)了NDV M蛋白是一種細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白。

蛋白質(zhì)核質(zhì)穿梭主要是由蛋白質(zhì)自身攜帶的NLS和核輸出信號(hào)(nuclear export signal, NES)所介導(dǎo)[16-18]。猿猴空泡病毒40(Simian virus 40, SV40)大T抗原NLS是第一個(gè)被鑒定的由單簇堿性氨基酸組成的NLS(126PKKKRKV132)[19]，隨后研究還發(fā)現(xiàn)由兩簇堿性氨基酸組成的非洲爪蟾核質(zhì)蛋白NLS(155KRPAATKKAGQAKKKK170)[20]；而NES則是由一段富含疏水性的氨基酸(如亮氨酸L、異亮氨酸I、纈氨酸V)組成，如人免疫缺陷病毒1型Rev蛋白NES(73LPLPPLERLTL83)[21]。通過(guò)對(duì)NDV M蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析和氨基酸點(diǎn)突變，研究證實(shí)了M蛋白中存在1個(gè)由兩簇堿性氨基酸組成的NLS[6]和3個(gè)由疏水性氨基酸組成的NES[22]介導(dǎo)M蛋白的細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭(圖1)。NLS介導(dǎo)的M蛋白入核需要在核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importin β1和RanGTP的幫助下完成[8]，但是迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未鑒定出與M蛋白NES相互作用的核輸出受體蛋白。另外，在NDV感染細(xì)胞期間M蛋白都能定位在核仁，研究發(fā)現(xiàn)主要是由M蛋白氨基端(aa 30—60)與核磷蛋白B23羧基端(aa 188—245)發(fā)生相互作用進(jìn)入細(xì)胞核仁[23]。因此，M蛋白aa 30—60可能是假定的核仁定位信號(hào)(putative nucleolar localization signal, pNoLS)(圖1)，這與Coleman等[6]的研究結(jié)果相一致，但是決定M蛋白核仁定位的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)還有待確證。以上研究結(jié)果表明，NDV M蛋白中存在NLS、NES和pNoLS分別介導(dǎo)了M蛋白的細(xì)胞核定位、細(xì)胞質(zhì)定位以及核仁定位。

2 NDV M蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核除了需要自身攜帶的NLS，還需要核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白的參與。核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白是一類與核孔選擇性運(yùn)輸有關(guān)的蛋白質(zhì)分子，包括importin α和importin β兩個(gè)家族成員，它們可以聯(lián)合識(shí)別和結(jié)合靶蛋白中攜帶的NLS，協(xié)助靶蛋白進(jìn)入細(xì)胞核[16,24-25]。但是，有研究證實(shí)importin α或importin β單獨(dú)介導(dǎo)的靶蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)效率要高于importin α/β共同介導(dǎo)的靶蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)[26-27]。近期，課題組通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)從雞胚成纖維細(xì)胞中篩選到NDV M蛋白與核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importin β1存在相互作用，免疫共沉淀和pull-down試驗(yàn)證實(shí)M蛋白通過(guò)其NLS區(qū)域與importin β1 aa 336—433(第8—10 HEAT Repeats，也是RanGTP結(jié)合區(qū)域)發(fā)生相互作用[8]。隨后的熒光共定位和洋地黃苷透化的HeLa細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)需要importin β1和RanGTP的共同參與[8]。有研究表明importin α 可以在importin β1 單獨(dú)介導(dǎo)的靶蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮抑制作用，利用免疫共沉淀和pull-down試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)importin α5 可以通過(guò)結(jié)合importin β1 與NDV M 蛋白發(fā)生相互作用[8]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi干擾importin β1蛋白的表達(dá)減少了M蛋白的細(xì)胞核定位，并且降低了NDV的復(fù)制能力和致病性：而干擾importin α5蛋白的表達(dá)卻增加了M蛋白的細(xì)胞核定位，并且增強(qiáng)了NDV的復(fù)制能力和致病性[8]。通過(guò)上述研究結(jié)果，可以確定核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importin α5 和importin β1 對(duì)M蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)以及NDV的復(fù)制和致病性的影響機(jī)制：核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importin β1 與NDV M 蛋白在細(xì)胞質(zhì)結(jié)合形成二元復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核后通過(guò)RanGTP 作用而解離，停留在細(xì)胞核中，這個(gè)過(guò)程有利于加快M 蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)速度以及促進(jìn)NDV的復(fù)制和致病性(圖2A)；而細(xì)胞質(zhì)中的importin α5 可以通過(guò)結(jié)合importin β1 與M 蛋白發(fā)生相互作用形成三元復(fù)合物，這個(gè)過(guò)程會(huì)減少M(fèi) 蛋白的細(xì)胞核定位，進(jìn)而影響NDV 的復(fù)制和致病性(圖2B)。

3 NDV M蛋白細(xì)胞核定位的功能研究進(jìn)展

3.1 M蛋白細(xì)胞核定位調(diào)節(jié)NDV基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

NDV基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，這個(gè)過(guò)程需要NP蛋白與病毒RNA相互作用并包裹其形成核衣殼，還與P蛋白和L蛋白一起形成核糖核蛋白體，共同調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[28-29]。對(duì)仙臺(tái)病毒(Sendai virus, SeV)、VSV和HRSV M蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，在病毒早期感染過(guò)程中M蛋白在細(xì)胞質(zhì)中可以通過(guò)與NP蛋白相互作用抑制病毒RNA聚合酶活性，從而抑制從病毒基因組轉(zhuǎn)錄到包裝成病毒粒子信號(hào)的轉(zhuǎn)換[30-32]。另外，在VSV和SeV核衣殼中額外加入M蛋白可以降低病毒RNA的轉(zhuǎn)錄能力[31, 33]。有研究證實(shí)NDV M蛋白與NP、HN和F蛋白存在相互作用[4]，這對(duì)病毒蛋白包裝成病毒樣顆粒有重要作用。最近課題組將NDV微型基因組質(zhì)粒與表達(dá)M蛋白或M蛋白NLS突變的質(zhì)粒分別共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于M蛋白NLS突變導(dǎo)致M蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞核，從而降低了病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平[34]。進(jìn)一步拯救的親本病毒(rSS1GFP)和M蛋白NLS突變體病毒(rSS1GFP-M/NLSm)分別感染細(xì)胞，同樣發(fā)現(xiàn)rSS1GFP-M/NLSm在細(xì)胞中的病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平明顯減低[34]。因此，可以確定的是M蛋白在NDV感染早期進(jìn)入細(xì)胞核能夠保證細(xì)胞質(zhì)中病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄達(dá)到一定的水平，然后M蛋白返回到細(xì)胞質(zhì)參與病毒粒子的組裝，這個(gè)過(guò)程對(duì)NDV完成正常的生活史具有重要意義。

3.2 M蛋白細(xì)胞核定位抑制細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄

病毒M蛋白在細(xì)胞核中能抑制宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，在多種病毒如VSV、HRSV、MeV、SV40、流感病毒(influenza virus, IV)、狂犬病病毒(rabies virus, RV)、病毒性出血性敗血癥病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)等已經(jīng)得到證實(shí)，但是其作用方式可能存在差異。例如，MeV M蛋白在細(xì)胞核中能結(jié)合轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，并且以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄[11]；VSV M蛋白在細(xì)胞核中能抑制細(xì)胞3種類型RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，并能滅活細(xì)胞核中重要的轉(zhuǎn)錄起始因子如TATA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子ⅡE和ⅡH等，達(dá)到抑制細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的目的[9,35]；而VHSV M蛋白能抑制基因啟動(dòng)子招募RNA聚合酶Ⅱ，并且抑制3種類型RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性[36]。

目前，在副黏病毒M蛋白抑制細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄方面的研究報(bào)道仍然較少。為了解NDV M蛋白是否具有抑制細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的功能，課題組利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究親本病毒rSS1GFP和突變體病毒rSS1GFP-M/NLSm分別感染細(xì)胞后的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與rSS1GFP-M/NLSm相比，親本病毒rSS1GFP感染細(xì)胞早期導(dǎo)致的大量上調(diào)基因主要與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制活性有關(guān)，而下調(diào)基因主要與DNA結(jié)合或RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性以及轉(zhuǎn)錄激活活性有關(guān)[34]。進(jìn)一步通過(guò)TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，親本病毒rSS1GFP感染細(xì)胞早期，與細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、RNA加工和修飾相關(guān)的蛋白表達(dá)量明顯降低，而在病毒感染晚期這種抑制作用減弱，但是突變體病毒rSS1GFP-M/NLSm感染細(xì)胞期間相關(guān)蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有明顯變化[37]。另外，在rSS1GFP感染細(xì)胞早期，與細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA降解、RNA聚合酶、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、剪接體和mRNA監(jiān)視相關(guān)的大多數(shù)蛋白均表現(xiàn)為下調(diào)[37]。此外，有研究報(bào)道M蛋白在細(xì)胞核中與細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基質(zhì)蛋白3、含溴結(jié)構(gòu)域蛋白2(bromodomain-containing protein 2, BRD2)發(fā)生相互作用[38-39]，并且M蛋白與BRD2相互作用能降低該蛋白的表達(dá)，這個(gè)過(guò)程可以促進(jìn)NDV基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[39]。以上研究結(jié)果表明，NDV感染細(xì)胞早期M蛋白在細(xì)胞核中能通過(guò)多種形式抑制細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄。

3.3 M蛋白細(xì)胞核定位影響細(xì)胞蛋白的表達(dá)

NDV感染細(xì)胞后能夠快速抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白多肽的積累且增加病毒特異性蛋白多肽的合成[40]，但是這種作用機(jī)制并不清楚。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)NDV感染細(xì)胞后能形成應(yīng)激顆粒(stress granule, SG)，通過(guò)PKR/eIF2α信號(hào)通路誘導(dǎo)穩(wěn)態(tài)SG形成，該SG可以特異性招募細(xì)胞mRNA，而病毒mRNA則逃逸出SG的包裹，以此影響細(xì)胞蛋白的翻譯和合成[41]。另外，NDV感染細(xì)胞后，細(xì)胞的真核翻譯系統(tǒng)以及相關(guān)的PI3k/Akt/mTOR和p38 MAPK/Mnk1通路迅速被激活，并且NDV NP蛋白與細(xì)胞翻譯起始因子eIF4E直接結(jié)合，抑制以1型帽子結(jié)構(gòu)為主的細(xì)胞mRNA翻譯，優(yōu)先翻譯NDV 0型帽子結(jié)構(gòu)的mRNA[42]。然而，對(duì)于NDV M蛋白是否參與抑制細(xì)胞蛋白的翻譯過(guò)程仍不清楚。核磷蛋白B23蛋白是一種多功能核仁蛋白，其羧基端的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞中主要涉及核糖體的成熟和裝配，破壞這個(gè)區(qū)域能抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程[43-45]。NDV M蛋白能與B23蛋白核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，并且在NDV感染期間能破壞B23蛋白的正常定位[23, 46]。因此，M蛋白可能通過(guò)與B23蛋白相互作用并且破壞其結(jié)構(gòu)和功能來(lái)影響細(xì)胞的翻譯。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，相比M蛋白NLS突變體病毒rSS1GFP-M/NLSm，親本病毒rSS1GFP感染細(xì)胞早期與細(xì)胞蛋白翻譯相關(guān)的核糖體蛋白表達(dá)量顯著降低，而在感染后期核糖體蛋白表達(dá)量才開(kāi)始上升[37]。另外，在rSS1GFP感染細(xì)胞早期，與細(xì)胞mRNA核輸出相關(guān)的蛋白，如轉(zhuǎn)錄和mRNA輸出因子(transcription and mRNA export factor, ENY2)、THO復(fù)合物亞基2(THO complex subunit 2, THOC2)、核帽結(jié)合蛋白亞基2(nuclear cap-binding protein subunit 2, NCBP2)、核孔復(fù)合蛋白153(nuclear pore complex protein 153, NUP153)、絲氨酸/精氨酸剪接因子3(serine/arginine-rich splicing factor 3, SRSF3)，表達(dá)量明顯下降[37]。因此，根據(jù)以上研究結(jié)果可以推測(cè)，M蛋白在細(xì)胞核中可能通過(guò)影響細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA核輸出、核糖體蛋白的表達(dá)以及核仁蛋白的功能達(dá)到抑制細(xì)胞蛋白翻譯的目的。

4 展望

RNA病毒包括雙鏈RNA病毒、單股正鏈RNA病毒和單股負(fù)鏈RNA病毒，是一類極其重要的病原體，雖然它們的M蛋白同源性不是太高，但從已報(bào)道的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)M蛋白具有許多相似的生物學(xué)功能，這為NDV M蛋白的功能研究提供了一定的借鑒和參考。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)NDV復(fù)制和致病性的研究大多集中在F、HN、NP和V蛋白，而對(duì)M蛋白的研究則主要是在M 蛋白與NDV 毒力和復(fù)制的關(guān)系以及以M 蛋白為核心的病毒樣顆粒形成機(jī)制和利用方面[47]。大多數(shù)副黏病毒M蛋白是一種細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白[48-49]，而對(duì)于M蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制和功能研究?jī)H見(jiàn)于尼帕病毒和SeV[48, 50]，但主要還是以泛素化所介導(dǎo)的M蛋白核輸入。最近姜維雨[51]也發(fā)現(xiàn)NDV M蛋白K119和K260存在泛素化修飾，有助于M蛋白的細(xì)胞核定位以及病毒樣顆粒的形成和出芽，并且K119發(fā)生泛素化修飾減少了與細(xì)胞蛋白的相互作用，使M蛋白能順利從細(xì)胞膜釋放。因此，NDV M蛋白與核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白發(fā)生相互作用或通過(guò)堿性氨基酸位點(diǎn)發(fā)生泛素化修飾能增加其入核的途徑，更有利于M蛋白進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮功能。另外，根據(jù)目前已報(bào)道的研究結(jié)果，雖然NDV M蛋白在細(xì)胞核中能抑制細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和影響細(xì)胞蛋白的翻譯，但主要是基于組學(xué)研究結(jié)果的推測(cè)，并沒(méi)有直接的證據(jù)。因此，NDV M蛋白細(xì)胞核定位降低了細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和mRNA核輸出相關(guān)蛋白的表達(dá)，它是否能像VSV M蛋白一樣與細(xì)胞蛋白R(shí)ae1-NUP98復(fù)合物[52-54]、TFIIH亞基p8[55]相互作用抑制細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，或是與核孔復(fù)合物蛋白相互作用抑制snRNA和mRNA的核輸出[56]，仍然值得我們進(jìn)一步深入研究。