大蒜素對阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰大鼠心功能及血精氨酸血管加壓素、尿水通道蛋白-2的影響

吳海波 王云燦 王學(xué)超

(河北省人民醫(yī)院心內(nèi)六科，河北 石家莊 050000)

阿霉素是臨床常用的廣譜高效腫瘤化療藥物，該藥物主要作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)，在多種腫瘤臨床治療中均得到廣泛應(yīng)用。但是阿霉素具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用，長期應(yīng)用可導(dǎo)致中毒性心肌炎、心律失常、心肌病、慢性心力衰竭(CHF)等〔1〕。據(jù)統(tǒng)計〔2〕，采用阿霉素化療的腫瘤患者慢性心衰發(fā)病率異常高于單純慢性心衰者，其可能原因與長期服用抗腫瘤物導(dǎo)致心臟負(fù)擔(dān)過重物密不可分，縮短患者生存年限。目前，對于阿霉素性慢性心衰疾病并沒有特效的藥物，然而，據(jù)有關(guān)資料報道大蒜素具有保護(hù)心肌的功能〔3,4〕。本研究探究大蒜素對阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰大鼠心功能的影響，并分析其血精氨酸血管加壓素(AVP)、尿水通道蛋白(AQP)-2變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 90只SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，7周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司實驗動物中心，實驗動物許可證：SCXK(京)2009-0004。

1.2實驗試劑和儀器 實驗中所用主要儀器和試劑為阿霉素(武漢宏信康精細(xì)化工有限公司)、大蒜素(楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司)、AVP試劑盒(IBL)、AQP-2試劑盒(Santa cruz)、水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)、大鼠隔離籠具(北京佳源興業(yè)科技有限公司)、玉米油(Spectrum)、多普勒超聲儀(徐州市凱信電子設(shè)備有限公司)、手術(shù)剪刀(上海華美實業(yè)有限公司)、真空采血管(浙江拱東醫(yī)療科技有限公司)、全自動酶標(biāo)儀(美國BioX科技有限公司)、-20℃冰箱(青島海爾)、高速離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司)、靜脈留置針(溫州華利醫(yī)療器械有限公司)。

1.3動物模型 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，水合氯醛麻醉并固定SD大鼠于專用固定器中，將大鼠尾部浸泡于45～50℃溫水1 min，75%酒精擦拭尾部，阿奇霉素共注射8次，分別于2、4 d皮下注射1 mg/kg，6 d、8 d皮下注射2 mg/kg，10 d、12 d皮下注射3 mg/kg，14 d、16 d皮下注射4 mg/kg。停止注射1 w內(nèi)監(jiān)測大鼠心衰情況，并根據(jù)建模過程中大鼠的飲食，體重，精神狀態(tài)變化給予適當(dāng)?shù)淖o(hù)理，保證模型成功。

1.4藥物處理方法 正常組和模型組10 ml/kg玉米油皮下注射處理，A、B、C、D大蒜素組分別尾靜脈緩慢注射含10、15、20、25 mg/kg劑量大蒜素的10 ml/kg玉米油。1 w 1次，連續(xù)注射8 w，同時給予抗生素等輔助處理，停藥、禁食24 h后分別收集SD大鼠尿液5 ml，并斷頸心臟采血5 ml。

1.5心功能檢查方法 測定SD大鼠開始使用大蒜素到停止用藥期間的心功能指標(biāo)，求平均值。麻醉固定大鼠于手術(shù)板上，仰臥心前備皮，西門子彩色多普勒超聲儀(ACUSO Sequoia 512，5L8w-s型高頻探頭，14.0 MHz)檢查超聲心功能指標(biāo)。記錄左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、左室短軸縮短率(FS)、左室重量(LVM)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.6血液、尿液處理方法 大蒜素使用8 w后，取大鼠尿液標(biāo)本于試管中，同時斷頸心臟采血于采血管中，尿液和血液標(biāo)本1 h內(nèi)在4℃的條件下離心(3 000 r/min)25 min，取上清，-20°冰箱保存，待用。

1.7血AVP、尿AQP-2檢測方法 根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作：①加樣：相應(yīng)反應(yīng)孔中分別添加100 μl的標(biāo)準(zhǔn)品和待測液體，充分混勻，酶標(biāo)板封蓋，并放置于37℃水浴恒溫中反應(yīng)120 min；②配液：蒸餾水以20倍稀釋洗滌液，備用；③洗板：用稀釋20倍后的洗漆液充分清洗反應(yīng)板4～6次，并于濾紙上印干；④分別對應(yīng)孔添加酶標(biāo)抗體工作液100 μl，并將反應(yīng)板37℃水浴條件下恒溫反應(yīng)60 min，洗板4～6次；⑤顯色：每孔分別加底物工作液100 μl，37℃避光反應(yīng)15～20 min；⑥終止：加終止液100 μl，混勻，酶標(biāo)儀測450 nm下的吸光值(OD)；⑦所測OD值-空白OD值作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值查出對應(yīng)濃度大小。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行ANOVA檢驗。

2 結(jié) 果

2.1心功能變化 模型組心功能各項指標(biāo)與正常組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：LVEDD、LVESD、LVM明顯增高，F(xiàn)S、LVEF明顯降低。A組LVEDD明顯高于正常組和C、D組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；LVESD值明顯高于正常組和B、C、D組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；LVM同樣明顯高于正常組和B、C、D組(P<0.05)，但與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；FS明顯低于正常組和D組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)，與B、C兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LVEF明顯低于正常組和C、D組(P<0.05)，較模型組明顯增高(P<0.05)，但與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。B組LVEDD和LVESD均明顯高于正常組和C、D兩組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；LVM明顯高于正常組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)，但與C、D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；FS明顯低于正常組和D組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)，與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LVEF明顯低于正常組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)，與C、D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。C組LVEDD、LVESD、FS、LVEF與正常組和模型組分別比較均差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LVM與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與D組比較，只有LVESD差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組LVEDD、FS、LVM與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；5個指標(biāo)與模型組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2血AVP、尿AQP-2含量變化 模型組血AVP、尿AQP-2與正常組比較均明顯增高(P<0.05)。A、B、C、D組血AVP和尿AQP-2均顯著高于正常組(P<0.05)，且低于模型組(P<0.05)，并隨著劑量的增加呈現(xiàn)依次降低趨勢，D組血AVP，尿AQP-2含量明顯降低。A、B、C、D組間兩兩比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組心功能指標(biāo)對比

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與A組比較:3)P<0.05；與B組比較:4)P<0.05；與C組比較:5)P<0.05；下表同

表2 各組血AVP、尿AQP-2水平比較

3 討 論

目前，CHF發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且導(dǎo)致其發(fā)病的因素很多，比如高血壓、糖尿病及心臟毒害作用藥物等，相關(guān)研究顯示，毒害類藥物引起的慢性心衰發(fā)病率越來越高，且在免疫力低下的患病老年人及腫瘤晚期患者中較為普遍〔5〕。調(diào)查顯示〔6〕，由阿霉素誘導(dǎo)的慢性心衰患者占據(jù)很高的比例，特別是在腫瘤患者中，由于其臨床治療效果差，患者生存質(zhì)量嚴(yán)重降低。一旦發(fā)生CHF，患者心功能將會逐漸被削弱，嚴(yán)重者甚至可能危及生命。研究指出〔7〕，在CHF患者中，由于機(jī)體內(nèi)壓力感受器被激活導(dǎo)致交感神經(jīng)異常興奮，進(jìn)而激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，使得AVP合成和分泌均明顯增加，進(jìn)而可導(dǎo)致機(jī)體對水分和鈉的重吸收顯著增加，加重機(jī)體損傷；另一方面，血VAP可以和腎臟V2受體相結(jié)合，進(jìn)而啟動信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，使得磷酸化AQP-2移位，促進(jìn)水分子跨膜轉(zhuǎn)運〔8〕。該因子對腎上腺皮質(zhì)激素分泌也有明顯促進(jìn)作用，使得尿AQP-2水平增加。據(jù)Della-Morte等〔9〕研究表明，由阿霉素誘導(dǎo)的CHF患者病程越長、病情越嚴(yán)重，血VAP和尿AQP-2水平也越高，提示二者均和CHF病情存在一定關(guān)聯(lián)。

研究表明〔10〕，大蒜素可改善阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰大鼠心肌結(jié)構(gòu)，恢復(fù)心肌細(xì)胞的整齊排列，清晰橫紋等正常細(xì)胞現(xiàn)象，同時有效調(diào)整白細(xì)胞介素(IL)-10/腫瘤壞死因子(TNF)-α比值，實現(xiàn)對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，推測大蒜素可能通過改善CHF心肌結(jié)構(gòu)和功能增強(qiáng)臨床療效。趙文萃等〔11〕研究顯示，大蒜素可有效改善CHF大鼠的LVESD、LVEDD、FS及射血分?jǐn)?shù)，降低血管緊張素(Ang)Ⅱ，TNF-α水平，有利于大鼠心肌形態(tài)和心室重構(gòu)。大蒜素在阿霉素誘導(dǎo)的CHF動物模型中應(yīng)用，能夠改善心功能，同時有效控制細(xì)胞因子水平，推測可在CHF患者臨床中推廣。同時國外最新研究認(rèn)為對CHF患者采用大蒜素同樣可通過減輕細(xì)胞毒性改善患者的心臟功能，控制心衰〔12〕。也有研究認(rèn)為大蒜素可防止大鼠心肌氧化損傷，抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，可能對CHF的改善有一定的影響〔13〕。目前認(rèn)為大蒜素具有抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤等多種藥理作用，其主要機(jī)制為抑凋亡、抗氧化損傷、減少Ca2+載體流失〔14〕，可能具有減輕心衰患者癥狀，保護(hù)心臟功能的作用，但是并沒有充分的數(shù)據(jù)證實。另有國外研究認(rèn)為〔15〕，大蒜素對CHF大鼠模型交感神經(jīng)興奮可能有抑制作用，進(jìn)而減輕對RAAS的刺激，減少VAP分泌量，使其對腎上腺皮質(zhì)激素分泌促進(jìn)作用減輕，故而血VAP、尿AQP-2水平顯著降低，且大蒜素干預(yù)濃度越高，其降低幅度越明顯，推測療效改善與此緊密相關(guān)。

本研究結(jié)果說明大蒜素對阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰大鼠的心功能及血AVP、尿AQP-2水平含量具有明顯積極的影響，且存在劑量依賴性，可能為慢性心力衰竭疾病的控制提供一定的參考價值，但是其藥物作用機(jī)制和臨床安全性并不清楚，還需深入研究。