ApN/TNF-α信號(hào)途徑在有氧運(yùn)動(dòng)防治ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的抗炎癥作用

吳衛(wèi)東

(鄭州大學(xué)體育學(xué)院，河南 鄭州 450044)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種常見(jiàn)的動(dòng)脈血管疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，其所致的心、腦血管疾病發(fā)病率和死亡率居各種疾病前列。AS病變特點(diǎn)是動(dòng)脈管壁增厚變硬，管腔縮小并失去彈性，動(dòng)脈內(nèi)膜上聚集呈黃色粥樣的脂質(zhì)，主要累及彈性及大中等肌性動(dòng)脈，一旦發(fā)展到阻塞動(dòng)脈管腔，則導(dǎo)致動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官缺血、壞死〔1〕。脂聯(lián)素(ApN)是脂肪細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)，是脂肪組織基因表達(dá)最豐富的蛋白產(chǎn)物之一。ApN與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可多方位抑制AS性細(xì)胞改變。正常人血液中ApN水平顯著高于AS患者〔2〕，所以AS的發(fā)生發(fā)展可能與血液中ApN水平的下降關(guān)系密切，同時(shí)對(duì)動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)ApN基因缺陷小鼠在血管受損后內(nèi)膜較野生型小鼠明顯增厚〔3〕。血清ApN水平不僅能預(yù)示AS的發(fā)生發(fā)展，并且在臨床上表現(xiàn)出抗AS的作用，因此通過(guò)提高ApN mRNA表達(dá)和血清水平已經(jīng)成為防治AS的一種新手段〔4,5〕。現(xiàn)有研究證實(shí)長(zhǎng)期慢性炎癥是導(dǎo)致AS的重要因素，其實(shí)質(zhì)是動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞損傷后的炎性纖維組織增生反應(yīng)〔6〕。AS斑塊中的巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞可以通過(guò)分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α擴(kuò)大血管壁的炎性反應(yīng)，增加白細(xì)胞聚集，從而刺激血管黏附分子(VCAM)-1 mRNA表達(dá)增加，使內(nèi)皮組織黏附更多的單核細(xì)胞，黏附的單核細(xì)胞還可移入內(nèi)膜進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)氧化能力的巨噬細(xì)胞〔7〕。改變靜態(tài)生活方式，適宜運(yùn)動(dòng)(有氧運(yùn)動(dòng))是預(yù)防AS的有效手段，但關(guān)于運(yùn)動(dòng)預(yù)防AS的確切機(jī)制尚未完全闡明。本研究以ApoE-/-小鼠為動(dòng)物模型，通過(guò)觀察小鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)后主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)的病理變化，探討有氧運(yùn)動(dòng)在防治AS過(guò)程中ApN通過(guò)主動(dòng)脈脂聯(lián)素受體(AdipoR)1、TNF-α信號(hào)通路發(fā)揮抗炎癥作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方案 8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只以二級(jí)條件飼養(yǎng),小鼠購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部〔合格證號(hào)：scxk(京)2006-2008〕，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為對(duì)照組(C)和運(yùn)動(dòng)組(E)，每組10只，兩組小鼠均飼以高脂膳食飼料(21%豬油，0.15%膽固醇，78.85%普通飼料)〔8〕。E組小鼠每日上午9～10時(shí)進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間，每周5次〔9〕。小鼠由第1～5周 10 m/min，30 min，逐漸遞增至13 m/min，60 min，并穩(wěn)定此運(yùn)動(dòng)量至14周末。

1.2取材 運(yùn)動(dòng)結(jié)束后所有小鼠麻醉，心尖取血，制備血清。心臟血管在體經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水灌流后取出全心臟和主動(dòng)脈，取附睪、腎周脂肪墊和腓腸肌，DEPC水沖洗，用濾紙吸干后稱重。取材前E組小鼠停止運(yùn)動(dòng)48 h，禁食過(guò)夜。

1.3測(cè)試指標(biāo)和方法 主動(dòng)脈病理觀察：全心臟標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定4 h，然后聚乙二醇和聚乙二烯醇的水溶性混合物(OCT)包埋進(jìn)行冰凍切片，切片厚度10 μm并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)。血清ApN含量測(cè)定：雙抗夾心酶聯(lián)免疫(ABC-ELISA)方法，試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。ApN mRNA測(cè)定：采用RT-PCR法檢測(cè)。Trizol一步法提取總RNA，采用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，試劑盒由美國(guó)Amresco公司提供，循環(huán)30次。引物序列檢索自NCBI-Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，ApN上游引物：5′-AATCATTATGACGGCAGCAC-3′，下游引物：5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3'；β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度511 bp，上游引物5′-CCATCTACGAGGGCTATGCT-3'，下游引物5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3'。主動(dòng)脈AdipoR1、TNF-α蛋白測(cè)定：采用Western印跡方法檢測(cè)。取100 mg腓腸肌充分剪碎加入裂解液，勻漿后離心(16 000/min，30 min)取上清液，測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整上樣量后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離，用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌后加一抗(抗體分別購(gòu)自美國(guó)Abcam公司和Santa cruz公司)4℃過(guò)夜。封閉-洗滌緩沖液(TBST)沖洗3次，加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗1∶3 000稀釋液孵育1 h后顯色，以各細(xì)胞因子與β-actin的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS14.0數(shù)據(jù)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1體重及體成分 根據(jù)附睪脂肪墊和腎周脂肪墊重量與體重的計(jì)算出的脂體比是反映機(jī)體內(nèi)脂肪含量的指標(biāo)。C、E兩組小鼠絕對(duì)體重?zé)o顯著變化〔分別為(37.25±2.40)g、(36.71±2.69)g〕，脂體比E組(2.53±0.38)小鼠顯著低于C組小鼠(3.64±0.49，P<0.05)，表明長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)雖未顯著影響ApoE-/-小鼠AS形成過(guò)程中的體重，但顯著減少了小鼠內(nèi)臟脂肪積累，改善了脂體比。

2.2主動(dòng)脈血管壁病理觀察 C組小鼠主動(dòng)脈血管壁纖維板分裂出現(xiàn)間隙，呈多層狀，內(nèi)膜增厚且失去原有的波浪狀，鏡下可見(jiàn)泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維斑塊，甚至斑塊有破裂出血，內(nèi)膜被淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)大量膽固醇結(jié)晶，顯示出易損斑塊的特征。E組小鼠主動(dòng)脈血管壁彈力纖維排列相對(duì)C組小鼠致密，內(nèi)膜輕度增厚，偶有斷層，可見(jiàn)少量脂質(zhì)斑塊和泡沫細(xì)胞，病變程度較C組明顯減輕，見(jiàn)圖1，表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠AS的發(fā)生、發(fā)展具有明顯的抑制和延緩作用。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈竇橫截面HE染色觀察(×100)

2.3脂肪組織ApN mRNA和血清ApN含量 E組小鼠脂肪組織ApN mRNA表達(dá)(1.92±0.10)及血清水平〔(0.59±0.07)mg/L〕顯著高于C組小鼠〔(1.23±0.11)、(0.43±0.05)mg/L，P<0.05〕。表明有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著提高ApoE-/-小鼠脂肪組織ApN mRNA的表達(dá)和血清ApN水平。

2.4主動(dòng)脈AdipoR1、TNF-α蛋白表達(dá) E組小鼠主動(dòng)脈AdipoR1蛋白顯著高于C組〔(1.31±0.15)vs(0.98±0.11)，P<0.05〕，E組小鼠主動(dòng)脈TNF-α蛋白顯著低于C組〔(0.92±0.09)vs(1.15±0.10)，P<0.05〕，見(jiàn)圖2，表明有氧運(yùn)動(dòng)顯著提高了主動(dòng)脈AdipoR1蛋白表達(dá)，抑制了主動(dòng)脈TNF-α蛋白表達(dá)。

圖2 Western印跡檢測(cè)主動(dòng)脈AdipoR1、TNF-α蛋白表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)已形成的AS病變有一定延緩作用，但有氧運(yùn)動(dòng)并不能逆轉(zhuǎn)已形成的AS。載脂蛋白(Apo)E的缺失會(huì)導(dǎo)致循環(huán)血液中膽固醇的積累而誘發(fā)AS〔8〕，ApoE-/-小鼠就是利用基因敲除技術(shù)，造成血液中膽固醇清除困難而不需要高脂飲食就會(huì)自發(fā)形成AS，且產(chǎn)生的AS斑塊，病變位置、病變過(guò)程與人類極為相似〔10,11〕。

ApN mRNA表達(dá)水平受多種因素影響，例如年齡、性別和環(huán)境等，運(yùn)動(dòng)是大量影響因素中重要的一個(gè)。有氧運(yùn)動(dòng)一旦確定合適的研究對(duì)象且制定有效的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、采用適宜的運(yùn)動(dòng)方式和控制合理的運(yùn)動(dòng)時(shí)間就可以顯著提高ApN mRNA表達(dá)水平。ApN是脂肪組織合成分泌的細(xì)胞因子，但人體不同部位脂肪組織ApN含量和分泌存在顯著差異，影響ApN水平的主要因素是內(nèi)臟脂肪組織〔12,13〕，然而ApN基因表達(dá)水平隨內(nèi)臟脂肪組織減少而升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示有氧運(yùn)動(dòng)雖未顯著改變小鼠的絕對(duì)體重，但可以有效控制其內(nèi)臟脂肪積累，同時(shí)有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著提高小鼠脂肪組織ApN表達(dá)和血清ApN含量，這可能是有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)減少內(nèi)臟脂肪積累而增強(qiáng)了脂肪組織ApN的合成與分泌。分析其機(jī)制一方面可能是炎癥因子TNF-α的表達(dá)量隨內(nèi)臟脂肪組織減少而降低，從而解除了TNF-α的高表達(dá)對(duì)ApN mRNA表達(dá)的抑制；另一方面可能是模型組小鼠外周的保護(hù)性消耗增多，同時(shí)代償性下降導(dǎo)致了ApN水平低于運(yùn)動(dòng)組小鼠。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了小鼠主動(dòng)脈AdipoR1蛋白的表達(dá)，降低了TNF-α蛋白的表達(dá)水平，提示有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)增強(qiáng)ApN活動(dòng)水平抑制了主動(dòng)脈TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，血管壁最初的炎癥反應(yīng)是通過(guò)炎癥細(xì)胞的增生達(dá)到保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的目的，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血管損傷的保護(hù)，但是血管壁炎癥如不能及時(shí)消除則會(huì)對(duì)內(nèi)皮組織和血管造成破壞，引發(fā)斑塊破裂及血栓等并發(fā)癥〔14,15〕。TNF-α的激活是炎癥激活的重要步驟之一，是炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與了眾多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展〔16〕。內(nèi)皮細(xì)胞被TNF-α激活后可增強(qiáng)單核細(xì)胞的黏附，這是血管性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性步驟〔17〕。ApN可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗AS的作用，分析其機(jī)制可能有以下兩方面：一是ApN與主動(dòng)脈AdipoR1結(jié)合后可增加周圍組織的胰島素敏感性。胰島素敏感性的增加可以阻斷TNF-α誘導(dǎo)NF-κB抑制蛋白磷酸化及NF-κB的激活，從而抑制黏附分子的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)血管壁和延緩AS斑塊發(fā)展的作用；二是ApN與主動(dòng)脈AdipoR1結(jié)合后可抑制主動(dòng)脈白細(xì)胞介素(IL)-6的表達(dá)。炎癥因子IL-6可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白，對(duì)宿主自身破壞性炎癥有增強(qiáng)作用；IL-6還可進(jìn)一步激活主動(dòng)脈TNF-α信號(hào)系統(tǒng)，從而形成正反饋的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)加強(qiáng)〔18〕。由此推測(cè)，有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)ApN抑制IL-6表達(dá)阻斷了TNF-α信號(hào)途徑，減少了相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮了保護(hù)主動(dòng)脈的作用。