復(fù)方中藥洗劑組方的體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究

郭姝彤， 艾彩蓮， 李寶莉

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 陜西 延安 716000)

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年生殖道感染的新發(fā)病例數(shù)高達(dá)3.33億[1]。在我國，近半數(shù)城鄉(xiāng)育齡婦女患有一種或多種下生殖道感染，其中細(xì)菌性陰道炎、真菌性陰道炎和滴蟲性陰道炎的檢出率最高，而細(xì)菌性陰道炎是育齡婦女最常見的陰道感染性疾病。全世界有數(shù)百萬婦女患念珠菌性陰道炎(真菌性陰道炎)，隨著抗生素和皮質(zhì)類固醇藥的普遍應(yīng)用，陰道念珠菌逐漸增多，直接影響到婦女的身心健康與生活質(zhì)量。目前治療的陰道炎藥物已有許多，但市場上尚無兼有治療和保健雙重作用的藥物， 國內(nèi)外也未見由五倍子、 白芷為主藥的 8 味中藥組成的復(fù)方液體制劑，因此研究抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、安全性高、方便患者使用和攜帶的藥物顯得尤為重要。

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院李寶莉教授自發(fā)研制的復(fù)方中藥洗劑對各種陰道炎不僅有針對性的治療作用，通過調(diào)整陰陽、補(bǔ)虛瀉實(shí)、扶正祛邪的整體辨證觀，治療陰道炎癥并調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，改善全身狀態(tài)，提高機(jī)體抵抗力，增強(qiáng)陰道的自凈作用。其中的8味單藥都具有一定的抑菌作用[2-10]，其研究開發(fā)運(yùn)用于臨床后將會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義。為此，本研究將復(fù)方中藥洗劑選用正交t值法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表合理安排出坤泰合洗劑中不同單藥及其劑量配比形成的所有組方，通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出最優(yōu)組方及其劑量配比，為臨床治療陰道炎用藥做前期研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 中藥材 白芷、五倍子、人參、石斛、當(dāng)歸、丁香、珍珠、川芎，以上8味中藥都采購于延安大學(xué)附屬醫(yī)院中藥庫。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcusanaerobius)ATCC27337、陰道加德納菌(Gardnerellavaginalis)ATCC14018共5種標(biāo)準(zhǔn)菌株，均購于北京中原公司ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株。肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，MARKⅡ全自動(dòng)厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)(荷蘭MART微生物公司)，ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、高壓蒸氣滅菌鍋(天津博訊實(shí)業(yè)有限公司)等。

1.2復(fù)方中藥洗劑最優(yōu)組方的確定

1.2.1 組方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用“正交t值法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表”確定復(fù)方中藥洗劑中不同單藥劑量配比所形成的所有組方，通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)，觀察出不同劑量配比的五倍子、白芷、人參等組成的復(fù)方中藥藥液對陰道常見5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株體外最低抑菌濃度(MIC)的影響，從而篩選出抑菌效果最好的1個(gè)組方，最后確定該洗劑的最優(yōu)組方及其劑量配比。8味單藥即白芷、五倍子、丁香、川芎、人參、當(dāng)歸、珍珠、石斛，依次分別用A、B、C、D、E、F、G、H表示，設(shè)定1、2兩個(gè)水平，1水平為高劑量，2水平為低劑量，見表1。采用“正交t值法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表”八因素兩水平安排并設(shè)計(jì)12種不同的組方，見表2。

表1 因素水平表/g

表2 正交t值法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.2 組方體外抑菌實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 組方的提取及其制備 在最佳提取工藝條件下[11]，將組方中每味中藥打粉后過篩(按照表2“正交t值法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表”的12種組方等比例縮小40倍)，共稱取5.5 g粉末，分別加入200 mL 80%乙醇于圓底燒瓶中，置于索氏提取器中進(jìn)行藥液初步提?。粚⒊醪教崛∷盟幰撼闉V后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙醇，干燥后獲得藥物粉末；最后使用10 mL容量瓶進(jìn)行藥液標(biāo)定，封口以備用。

1.2.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 取一接種環(huán)菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)平板內(nèi)打4個(gè)圓孔，向每個(gè)圓孔里加入40 μL相同濃度的不同藥液。將需氧菌于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h，厭氧菌先放入?yún)捬豕藓笾糜谕慌囵B(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)好后，測量平板上抑菌圈的直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果

2.112種組方的體外抑菌作用組方(1)～(10)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，組方(11)對白色念珠菌、大腸桿菌、厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 12種組方的體外抑菌作用

注:與組方(12)比較，▲P<0.05。

2.2最優(yōu)組方的確定組方(1)～(10)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12),經(jīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組方(1)～(7)、(9)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組方(1)、(4)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組方(1)～(10)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組方(1)～(9)的體外抑菌作用優(yōu)于組方(12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組方(1)對白色念珠菌、大腸桿菌、厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌的抑菌作用，見表4～8。

2.3復(fù)方藥效學(xué)的參數(shù)值8味單藥對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌的抑菌作用都以高劑量的貢獻(xiàn)值大，除白色念珠菌的珍珠高劑量和低劑量相當(dāng)，厭氧消化鏈球菌的人參高劑量和低劑量相當(dāng)，而陰道加德納菌的石斛以低劑量為大。根據(jù)8味單藥的貢獻(xiàn)值大小，排列順序依次為：白色念珠菌：A1>B1>D1>F1>H1>E1>C1>G1；大腸桿菌：A1>B1>D1=H1>C1=E1>F1>G1；金黃色葡萄球菌：A1>D1>G1>F1>C1>B1>H1>E1；厭氧消化鏈球菌：A1>B1>F1>C1>D1>G1>H1>E1；陰道加德納菌：A1>B1>D1=F1>E1>C1=H2>G1；經(jīng)綜合考慮，單藥的貢獻(xiàn)值由大到小為A、B、D、F、C、H、E、G，即白芷、五倍子、川芎、當(dāng)歸、丁香、石斛、人參、珍珠粉，見表9。

2.4配伍組的相互作用12種組方中各單藥對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌的抑菌作用,有相加或拮抗作用。白色念珠菌：組方(3)～(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(2)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；大腸桿菌：組方(1)、(2)、(11)、(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)～(10)相互起拮抗作用；金黃色葡萄球菌：組方(2)、(4)、(5)、(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(3)、(6)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌：組方(1)、(2)、(5)、(8)、(10)和(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)、(4)、(6)、(7)、(9)和(11)相互起拮抗作用，見表10。

表4 12種組方對白色念珠菌的正交t值實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表5 12種組方對大腸桿菌的正交t值實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表6 12種組方對金黃色葡萄球菌的正交t值實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表7 12種組方對厭氧消化鏈球菌的正交t值實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表8 12種組方對陰道加德納菌的正交t值實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組間比較

注：水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表9 不同單藥抑菌活性對組方藥效學(xué)的貢獻(xiàn)值

注: 參數(shù)值:“+”代表促進(jìn)作用，“-”表示抑制作用；水平1為高劑量，水平2為低劑量。

表10 12種組方對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌的正交t值配伍組相互作用性質(zhì)

注：Q：相互作用指數(shù)，Q>0：協(xié)同作用，Q<0：拮抗作用，Q=0：相加作用。

3 討論

不同中藥提取物的抑菌活性不同，大多數(shù)中藥的有效提取物對細(xì)菌、病毒等都有一定的作用[12]。本研究結(jié)果表明，12種組方對白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株均有一定的抑菌效果，以組方(1)的t值最大，P值最小。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，8味單藥對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用都以高劑量的貢獻(xiàn)值大，除白色念珠菌的珍珠高劑量和低劑量相當(dāng)，厭氧消化鏈球菌的人參高劑量和低劑量相當(dāng)，而陰道加德納菌的石斛以低劑量為大。8味單藥對不同標(biāo)準(zhǔn)菌，貢獻(xiàn)值的大小不同，經(jīng)綜合考慮，單藥的貢獻(xiàn)值大小，排列順序依次為白芷、五倍子、川芎、當(dāng)歸、丁香、石斛、人參、珍珠。12種組方中各單藥對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用,有相加或拮抗作用。白色念珠菌：組方(3)～(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(2)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；大腸桿菌：組方(1)、(2)、(11)、(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)～(10)相互起拮抗作用；金黃色葡萄球菌：組方(2)、(4)、(5)、(7)、(9)和(10)相互疊加起相加作用，而組方(1)、(3)、(6)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；厭氧消化鏈球菌和陰道加德納菌：組方(1)、(2)、(5)、(8)、(10)和(12)相互疊加起相加作用，而組方(3)、(4)、(6)、(7)、(9)和(11)相互起拮抗作用。

復(fù)方中藥洗劑組方的體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究中，12種組方對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果受外界許多因素的影響，如培養(yǎng)基的類型及其pH值、標(biāo)準(zhǔn)菌的種類、接種菌量的多少、培養(yǎng)的溫度等，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床應(yīng)用效果也存在差異。故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是在一定條件下12種組方對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑菌作用結(jié)果。

本研究顯示12種組方對5種ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌均有一定的抑菌作用，以組方(1)的抑菌效果最強(qiáng)，即高劑量組方為最優(yōu)。組方(1)也是復(fù)方中藥洗劑的原方，以白芷和五倍子為君藥(即主藥)，當(dāng)歸、丁香、石斛、人參和珍珠粉為臣藥，川芎為佐使之藥。

本研究是在復(fù)方中藥洗劑單藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展的工作,采用體外抑菌實(shí)驗(yàn)對12種組方初步進(jìn)行了研究，但不能說明有拮抗作用的組方抑菌效果不好，有待進(jìn)一步研究。另外，本實(shí)驗(yàn)只是初步進(jìn)行了最優(yōu)組方篩選的體外抑菌實(shí)驗(yàn),還需對復(fù)方中藥洗劑的體內(nèi)研究，為今后投入臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。