HPLC法同時(shí)測定大鼠尿樣中秦皮甲素和秦皮乙素的濃度

楊建華， 迪麗拜爾·馬木提， 王曉梅， 王 梅， 胡君萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部； 2藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

藥物的排泄是藥代動(dòng)力學(xué)研究的主要部分，經(jīng)尿液及糞便排泄是藥物排出體外的主要途徑，能較直觀反映藥物的體內(nèi)代謝過程和排泄特征，其中藥物的腎臟排泄是目前大多數(shù)藥物的最主要排泄途徑[1]。秦皮甲素和秦皮乙素均屬于香豆素類化合物，是毛菊苣(Cichoriumglandulosum)保肝作用的主要有效成分[2-4]。本課題組前期對(duì)毛菊苣藥材中秦皮甲素、秦皮乙素等5種主要成分進(jìn)行了含量分析[5]，并研究了兩者在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)[6]以及在大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物[7]。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取富集大鼠尿液中的秦皮甲素和秦皮乙素，用HPLC法進(jìn)行分離測定，建立了HLPC法同時(shí)測定大鼠尿中秦皮甲素與秦皮乙素的方法，并初步探索了其在大鼠尿中的藥動(dòng)學(xué)行為，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Shim-pack VP-ODS色譜柱(日本島津島津)，INLUCK T74420型C18固相萃取小柱(北京英萊克科技發(fā)展有限公司)，Microfuge 22R型高速低溫離心機(jī)(貝克曼科技發(fā)展有限公司)，UB-7型pH計(jì)(北京丹佛儀器有限公司)，S-114型電子天平(北京丹佛儀器有限公司)，VORTEX-5型漩渦振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，KQ-200 VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HSC-24A型氮吹儀(天津HENGAO科技發(fā)展有限公司)，Milli-Q型超純水系統(tǒng)(上海摩速科學(xué)器材有限公司)。

1.2試藥秦皮甲素對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)09040722)，秦皮乙素對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)09040724)，替硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品鑒定所，批號(hào)10036-200703)，色譜純甲醇、乙腈(美國Fisher公司)，水為超純水(自制，Milli-Q型超純水系統(tǒng))。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6只SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(新)2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制稱取秦皮甲素對(duì)照品和秦皮乙素對(duì)照品各0.050 g置于25 mL容量瓶，配成秦皮甲素與秦皮乙素濃度為2.0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。稱取替硝唑?qū)φ掌愤m量配制濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2色譜條件色譜柱為Shim-pack VP-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸(13∶87)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫為35℃，檢測波長為339 nm。在此色譜條件下秦皮甲素與秦皮乙素色譜峰分離度均大于1.5，拖尾因子分別為0.994 2和1.035 4，理論塔板數(shù)分別為4 973和6 128，均符合含量測定要求。

2.3大鼠尿液樣品的收集SD大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，收集大鼠0～48 h的空白尿，分別以秦皮甲素(66.6 mg/kg體質(zhì)量)和秦皮乙素(77.4 mg/kg體質(zhì)量)灌胃，收集0～1、1～3、3～6、6～10、10～24、24～36、36～48 h的尿液，-20℃冰箱冷凍儲(chǔ)藏，備用。

2.4大鼠尿樣的處理固相萃取小柱先依次用甲醇3 mL，水3 mL活化[8]，取尿樣500 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻后通過已活化的固相萃取小柱，用1 mL蒸餾水淋洗，繼用甲醇1 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃水浴上氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，于10 000 r/min離心5 min，取上清液5 μL,進(jìn)樣。

2.5專屬性考察在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，大鼠空白尿樣中無秦皮甲素、秦皮乙素和內(nèi)標(biāo)峰出現(xiàn)，證明大鼠尿樣中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品及內(nèi)標(biāo)的測定,見圖1、2。

圖1 大鼠空白尿液HPLC色譜圖

2.6基質(zhì)效應(yīng)取空白尿液，按“2.4”項(xiàng)下方法先處理后再加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，配制成0.1、1.0、10.0 μg/mL濃度的3個(gè)質(zhì)控(QA)樣品，每個(gè)濃度2份，吹干后復(fù)溶進(jìn)樣；同時(shí)相應(yīng)濃度的對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣，記錄峰面積，加入尿樣基質(zhì)的秦皮甲素和秦皮乙素的峰面積(A)與未加尿樣基質(zhì)的峰面積(A0)的比值，即為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明秦皮甲素與秦皮乙素的基質(zhì)效應(yīng)(MS)與內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)效應(yīng)(MS-IFA)在0.8～1.1，均能滿足方法學(xué)要求，見表1。

(注：1.秦皮甲素；2.替硝唑；3.秦皮乙素)

2.7線性關(guān)系與檢出限取混合對(duì)照品溶液配制秦皮甲素與秦皮乙素濃度分別為5、25、50、250、500 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取大鼠空白尿樣480 μL共5份，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL、濃度為50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻，使SD大鼠尿液中秦皮甲素與秦皮乙素的濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL。按“2.4”項(xiàng)下方法操作，在前述色譜條件下進(jìn)行測定。分別用秦皮甲素、秦皮乙素的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(F1，F(xiàn)2)對(duì)秦皮甲素、秦皮乙素濃度(X1，X2)進(jìn)行直線回歸，求得的回歸方程分別為：F1=0.121 4X1-0.028 3，r=0.998 5(n=5)；F2=0.138 9X2-0.043 1，r=0.999 1(n=5)。結(jié)果秦皮甲素和秦皮乙素尿樣在0.1～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限分別為0.055 7 μg/mL和0.060 0 μg/mL。

表1 秦皮甲素和秦皮乙素在大鼠尿中的基質(zhì)效應(yīng)(n=2)

2.8精密度試驗(yàn)取濃度分別為0.1、1.0、10.0 μg/mL的QA樣品各5份，分別按“2.4”項(xiàng)下方法處理尿樣，24 h內(nèi)重復(fù)測定5次，連續(xù)測定5 d，秦皮甲素的日內(nèi)、日間精密度RSD≤6.63%，秦皮乙素的日內(nèi)、日間精密度RSD≤7.61%，表明方法精密度良好，見表2。

表2 秦皮甲素和秦皮乙素大鼠尿樣日內(nèi)、日間精密度(n=5)

2.9回收率試驗(yàn)取高、中、低濃度的3組QA樣品測定濃度，另取3組相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，未經(jīng)處理直接進(jìn)樣，前后兩個(gè)濃度的比值為提取回收率。結(jié)果表明，高、中、低 3個(gè)濃度的提取回收率均大于70%，見表3。

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)取高、中、低濃度的3組QA樣品，于4℃冰箱中放置0、4、12、24 h后取出，置于室溫進(jìn)樣測定。將放置4、12、24 h的樣品與其處理后立即進(jìn)樣的數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析比較，觀察其濃度變化。結(jié)果表明秦皮甲素、秦皮乙素尿液樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定，見表4。

表3 秦皮甲素，秦皮乙素在大鼠血漿中的回收率(n=3)

2.11大鼠尿樣中秦皮甲素和秦皮乙素排泄參數(shù)秦皮甲素和秦皮乙素灌胃給予大鼠后不同時(shí)間段尿中測得的累積排泄量數(shù)據(jù)，見表5。尿藥排泄數(shù)據(jù)經(jīng)3P87藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序采用速度法來計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，秦皮甲素體內(nèi)滯留時(shí)間為1.280 3 h，ke=0.063 1/h，t1/2=10.983 h；秦皮乙素體內(nèi)滯留時(shí)間為3.396 9 h，ke=0.064 0/h，t1/2=10.828 h。兩種藥累積排泄百分率分別為0.578%和0.355%，秦皮乙素48 h累積尿藥排泄量大于秦皮甲素，見圖3。

表4 秦皮甲素和秦皮乙素的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=4)

表5 秦皮甲素和秦皮乙素尿藥累積排泄量

圖3 大鼠尿樣中秦皮甲素和秦皮乙素的累積排泄率

3 討論

萃取法是生物體內(nèi)藥物分析測定前樣品處理應(yīng)用最多的分離、純化方法。萃取法包括液-液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。SPE原理是采用適當(dāng)填料的小柱經(jīng)合理的洗脫步驟后使得被分析物與雜質(zhì)干擾分離，該方法最大優(yōu)點(diǎn)是處理樣品干凈，若洗脫條件優(yōu)化恰當(dāng)，還具有回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)考察了C18與聚酰胺2種不同填料的固相萃取柱，結(jié)果表明C18柱對(duì)秦皮甲素、秦皮乙素均有較強(qiáng)的吸附性，處理樣品干凈，無明顯基質(zhì)效應(yīng)，萃取回收率高。實(shí)驗(yàn)還考察樣品最佳上樣量，淋洗液的種類和體積，洗脫液的種類和體積，最后確定固相萃取小柱先依次用甲醇3 mL，3 mL水活化，尿液樣品500 μL，1 mL蒸餾水淋洗，1 mL甲醇洗脫時(shí)，樣品過柱、淋洗、洗脫過程中損失的最小，回收率高，沒有雜質(zhì)峰干擾。

口服香豆素在生物體胃腸道中很快被吸收并在體內(nèi)分布，并正常代謝，少許以原形排泄[9-11]。本研究結(jié)果顯示：大鼠口服秦皮甲素、秦皮乙素后，秦皮甲素最大的尿排泄量發(fā)生在0～1 h時(shí)間段內(nèi)，而秦皮乙素最大尿排泄量發(fā)生在3～6 h時(shí)間段內(nèi)，且秦皮甲素體內(nèi)滯留時(shí)間短，累積排泄百分率低；根據(jù)尿藥排泄參數(shù)可知秦皮甲素、秦皮乙素口服后吸收快，迅速達(dá)到峰濃度，體內(nèi)消除快，秦皮甲素、秦皮乙素僅極少部分以原形藥物從腎排泄，絕大部分以代謝產(chǎn)物從體內(nèi)排泄，提示秦皮甲素經(jīng)胃酸進(jìn)行苷鍵水解為秦皮乙素后發(fā)生吸收，主要的代謝產(chǎn)物均為秦皮乙素的還原、水解及二相代謝產(chǎn)物。