長白山野生松針粉抗氧化及抗衰老作用的研究

孟永海，懷雪，翟春梅，李廷利，卞宏生，馬智超，孟祥瑛，王艷艷，，*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗室，黑龍江哈爾濱150040）

松針（pineneedle）為松科松屬植物的葉，別名豬鬃松葉、松毛、山松須[1]。松針歷史悠久，《本草綱目》記載“松針，氣味苦、溫、無毒，久服令人不老，輕身益氣，主治風濕瘡，生發(fā)，安五臟，守中，不饑延年。松針內(nèi)富含糖類、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量礦物元素、維生素、抗菌素、生物黃酮類物質(zhì)、莽草酸、精油、葉綠素、木脂素、不飽和脂肪酸、酶與輔酶等營養(yǎng)素和活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。松針的主要藥理活性有抗血小板聚集活性，降血脂，降血糖，鎮(zhèn)痛抗炎，祛痰及平喘，抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，抗菌，抗突變效應(yīng)，抗疲勞等藥理作用[2]。其活性成分和藥理作用決定了松針在食品保健方面的特殊性。早在上世紀90年代，將松葉的有效成分溶解于貴釀酒中，使該酒具有護肝、延緩衰老、降壓利尿等功效[3]。近年來，松針開發(fā)成含維生素C、維生素B1、維生素B2等對人體保健大有益處的松針飲料，具有潤肺益氣，除風止痛的松針茶，用松脂提取的天然香料等[4]。本文以衰老小鼠和果蠅為生物模式，對長白山野生松針的抗氧化及抗衰老作用進行研究，為其功能食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性小鼠10只，ICR雄性老齡鼠20只，體重（20±2）g：均由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心提供；野生型Canton S品系黑腹果蠅：由中國科學院上海生命科學院果蠅技術(shù)平臺提供。

1.2 試劑與儀器

松針：產(chǎn)自吉林長白山；MDA試劑盒、SOD試劑盒、BCA試劑盒、GSH試劑盒（批號均為20170809）：南京建成生物研究所；FJ-200高速萬能粉碎機：上海申勝儀器公司；HH.WZ.CY600電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備公司；CT15RE高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；AL 204電子天平：美國METTLER TOLEDO公司；EVOLUTION 260紫外分光光度計：美國THERMO公司；EPOCH12酶標儀：美國BIOTEK公司。

2 試驗方法

2.1 小鼠抗氧化實驗

選取ICR青年與老年小鼠30只，按照文獻方法加以改進[5]，分3組即老年給藥組、老年模型組、青年對照組。松針粉碎過篩，按照散劑配制[6]，給藥劑量為5 g/kg，給藥30 d。老年模型組、青年對照組給等體積的生理鹽水。末次給藥后，眼球取血，低溫離心，硫代巴比妥酸法測定血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羥胺法測定血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。冰上取肝組織，微板法測定肝組織中蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）[2]、比色法測定谷胱甘肽（glutathion，GSH）的含量。

2.2 果蠅壽命的實驗

果蠅培養(yǎng)基的制備采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：蒸餾水46 mL，玉米粉 4.2 g，蔗糖 3.1 g，瓊脂 0.3 g，在培養(yǎng)基中添加不同劑量（高1.845%、中0.461%、低0.115%）的松針粉，對照組則給予正常培養(yǎng)基飼養(yǎng)。煮沸至糊狀，停止加熱，待溫度降至60℃～70℃時，加入酵母粉0.3 g，攪拌均勻，加入丙酸0.3 mL，攪拌均勻，立即分裝至果蠅管中。參照文獻方法加以改進[7-9]，對果蠅行為學進行考察。

2.2.1 壽命實驗

收集12 h內(nèi)羽化成蟲的果蠅，隨機分為對照組和給藥組，每組雌雄各100只，在（25±4）℃、相對濕度為（60±10）%、光/暗時間為12 h/12 h的恒溫恒濕智能培養(yǎng)室中培樣。每4天更換一次培養(yǎng)基并觀察記錄果蠅的情況。計算平均壽命，中間壽命，最高壽命。

2.2.2 亞急性氧化損傷實驗

取30日齡果蠅，每組雌雄各100只，果蠅饑餓兩小時后分別給予含20%的H2O2的6%的葡萄糖溶液，每4小時記錄一次，直至果蠅全部死亡。

2.2.3 衰老果蠅的攀爬實驗

收集12 h內(nèi)羽化成蟲的果蠅，每組10只果蠅，雌雄各半。于第0、10、20、30天移入空的果蠅管中，觀察10 s內(nèi)攀爬超過8 cm處的果蠅只數(shù)。每組重復(fù)實驗5次。

2.2.4 對果蠅體內(nèi)水分含量的影響

收集12 h內(nèi)羽化成蟲的果蠅，每組雌雄各50只，飼養(yǎng)至30 d，稱初重，放入干燥箱中（55℃），1 h后再次稱重，兩次重量差即為果蠅體內(nèi)水分含量。每組重復(fù)實驗4次。

2.2.5 生殖實驗

分別取7、15、30 d蠅，每管雌雄各一只，飼養(yǎng)3 d后取出，記錄第1天出生的子代蠅個數(shù)，連續(xù)記錄7 d，每組實驗平行6次。

2.3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 17.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間做t檢驗，P<0.05則表示有顯著性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.01為極顯著性差異。（果蠅實驗中，給藥組雌果蠅與空白對照組雌果蠅比較，雄果蠅與空白對照組雄果蠅比較）。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清SOD、MDA含量以及肝組織GSH含量

小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量見表1。

表1 小鼠血清SOD、MDA及肝組織GSH含量（n=10）Table 1 The content of SOD，MDA，and liver homogenate GSH in mice（n=10）

與老年模型組相比，青年對照組MDA、SOD及肝組織GSH含量均有極顯著差異（P<0.01），說明正常生理下衰老小鼠與青年小鼠相比，衰老指標發(fā)生明顯變化。但老年給藥組SOD和GSH含量與老年模型組相比，有顯著性差異（P<0.05），MDA含量雖無顯著性差異，但有降低趨勢。這可能與給藥時間不足有關(guān)。此實驗表明，給與一定劑量的松針粉，可回調(diào)衰老小鼠的抗氧化指標，有一定的延緩衰老的效果。

3.2 松針粉對果蠅壽命相關(guān)行為學指標考察結(jié)果

3.2.1 松針粉對果蠅壽命的影響

松針粉對果蠅壽命的影響見表2。

與果蠅空白對照組相比，各給藥組的果蠅平均壽命和最長壽命，均有不同程度的延長，與對照組相比，各給藥組雌雄果蠅平均壽命均呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），中、低劑量組雌雄果蠅的最長壽命也呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）。說明果蠅終身補充一定劑量的松針粉，可延長自身壽命。

果蠅壽命存活率見圖1。

表2 松針粉對果蠅壽命的影響（n=100）Table 2 Lifespan parameters in drosophila following pine supplement（n=100）

圖1 果蠅壽命存活率折線圖（n=100）Fig.1 Graph of drosophila melanogaster’s survival rate（n=100）

3.2.2 松針粉對果蠅亞急性氧化損傷實驗

松針粉對果蠅亞急性氧化損傷的作用見表3。

在亞急性氧化損傷實驗中，與空白對照組相比高劑量組雌雄平均存活時間呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）；中劑量組雌雄果蠅呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）；低劑量組均無顯著性差異。

3.2.3 松針粉對不同時期果蠅的攀爬活動的影響

松針粉對不同時期果蠅的攀爬活動的影響見表4。

表3 松針粉對果蠅亞急性氧化損傷的作用（n=100）Table 3 Survival time parameters in drosophila exposed to H2O2 following pine supplement（n=100）

表4 松針粉對不同時期果蠅的攀爬活動的影響（n=5）Table 4 Climbing ability in drosophila following pine supplement（n=5）

與空白對照組相比，各給藥組10日齡雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01），低劑量組雌果蠅攀爬能力顯著增加（P<0.05）；高、中劑量給藥組20日齡雄果蠅的攀爬能力顯著增加（P<0.05或P<0.01），中劑量組雌果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）；高劑量組30日雄果蠅的攀爬能力有極顯著性差異（P<0.01）。果蠅攀爬實驗折線圖見圖2。

3.2.4 松針粉對果蠅體內(nèi)水分含量的影響

松針粉對果蠅體內(nèi)含水量的影響見表5。

圖2 果蠅攀爬實驗折線圖Fig.2 Climbing ability in drosophila following pine supplement

表5 松針粉對果蠅體內(nèi)含水量的影響（n=4）Table 5 Detection of water content in drosophila in each group（n=4）

與空白對照組相比，高劑量組體內(nèi)水分含量無顯著性差異；中劑量組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）；低劑量組雄果蠅與對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）；研究發(fā)現(xiàn)各組雌果蠅的體內(nèi)含水量明顯高于雄果蠅。

3.2.5 松針粉對果蠅繁殖能力的影響

松針粉對果蠅繁殖能力的影響見圖3。

圖3 不同日齡果蠅繁殖果蠅數(shù)統(tǒng)計Fig.3 Reproduction parameters in drosophila following pine supplement

與空白對照組相比，各階段高劑量組果蠅子代個數(shù)減少，中劑量組果蠅子代數(shù)增加（P<0.05或P<0.01），低劑量組30 d果蠅的子代數(shù)有顯著差異（P<0.01）。值得注意的是，隨著日齡增加對照組果蠅子代數(shù)呈降低趨勢，而終生補充低劑量松針粉的果蠅隨著日齡增加，果蠅子代數(shù)呈上升趨勢，尤以30日齡的果蠅產(chǎn)的子代數(shù)最多，可見終生低劑量補充松針粉可大大提高老年時期生物的繁殖能力，功效明顯。

4 討論

清除自由基延緩衰老[10]的學說被越來越多人認可，衰老過程中自由基促成的脂質(zhì)過氧化作用亦隨齡增高[11]，SOD是存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶系，能有效地清除細胞代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基[12]，GSH可以認為是生物體內(nèi)氧自由基消除系統(tǒng)的重要防線，主要起保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用[13]。細胞中的脂類物質(zhì)受到氧自由基作用時，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一些分解產(chǎn)物如MDA等。MDA作為機體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，其高低又間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[14-15]。

檢測動物的壽命是目前研究老齡化和抗老齡化中應(yīng)用普通、較有權(quán)威的試驗手段之一，果蠅這種模式生物[16]用于壽命實驗的先進性和機理探討的優(yōu)勢較為明顯，其優(yōu)點在于生命周期短、繁殖力強[17]，遺傳背景清晰又具有相對簡單的腦[18]，有方便的遺傳學工具[19]，且基因組小[20]，易于分析操作。

小鼠抗氧化實驗中老年給藥組與老年模型組相比，MDA含量略降低，SOD、GSH含量明顯升高，說明松針粉對老齡小鼠有一定的抗氧化效果。影響果蠅壽命存在多種因素[21-22]，在盡可能保證外界因素一致的情況下進行果蠅壽命實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)松針可顯著性延長各個給藥濃度的雌雄果蠅壽命。大量文獻已報道松針具有體外抗氧化能力[23-25]，在果蠅培養(yǎng)基中添加不同濃度松針粉喂養(yǎng)30 d后，進行氧化損傷實驗中，隨著藥物濃度的增加與果蠅平均存活時間成正相關(guān)，說明松針不僅在體外有一定的抗氧化作用，而且在動物體內(nèi)也有顯著的抗亞急性氧化損傷效果。運動和衰老息息相關(guān)[26]，利用正常果蠅具有反趨地性行為的特性進行攀爬測試[27]，松針粉可以提高和改善老年果蠅的攀爬運動能力，增加老年果蠅體內(nèi)含水量，改善果蠅物質(zhì)代謝與能量代謝。中、低濃度的松針粉還可增加果蠅的子代數(shù)，這些實驗說明松針粉可通過提高機體抗氧化能力而抗衰老，其機理可能與其提高抗氧化酶的活性及其抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生等一系列抗氧化作用密切相關(guān)。其分子機制有待深入研究，它必將在如今老齡化社會發(fā)揮更大作用。