HPLC法快速篩查保健酒中那非藥物及質譜確證

（徐州工業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇徐州221140）

保健酒是以優(yōu)質白酒為酒基，配以山藥、枸杞子、淫羊霍、黃芪、當歸等，采用現代生物工程技術提取其有效活性物質釀制而成，主要用于調節(jié)人體生理機能，以保健、養(yǎng)生、健體為目的，滿足消費者對美好生活的需求[1-4]。但隨著市場經濟競爭加劇、保健品促銷方式繁多和人們對養(yǎng)生保健的重視，一些不良廠商向保健酒中非法添加化學藥物，以達到保健、滋補、壯陽、強身等功效，其中補腎壯陽類保健酒是那非類藥物違規(guī)添加重災區(qū)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布《關于51家保健酒、配制酒企業(yè)69種產品違法添加行為的通告》（2015年第45號），通告部分保健酒、配制酒生產企業(yè)存在違法添加他達那非、伐地那非、西地那非、硫代艾地那非、紅地那非等化學物質，并在產品名稱、標識、標簽上明示或暗示壯陽、性保健等功能[5-7]。而這些那非類藥物通常作為臨床治療男性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的處方藥物，如他達那非、伐地那非和西地那非。若誤食那非類藥物易引起一定的不良反應，如頭痛、消化不良、肌肉疼痛、鼻塞、皮疹和視覺障礙等癥狀，尤其是心血管疾病和糖尿病患者若長期誤食甚至造成突然死亡[8-11]。為此，國家已嚴禁保健食品中違規(guī)添加。

目前那非類藥物檢測方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[12-14]、高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-17]和高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜法（high performance liquid chromatography-four stage rod time-offlight tandem mass spectrometry，HPLC/Q-TOF MS）[18-20]，其中質譜法由于檢出限低、靈敏度高而被廣泛用于那非類藥物檢測，但由于質譜儀價格昂貴、分析成本高、專業(yè)操作復雜而難以滿足企業(yè)批量的檢測需要。本文以14種那非類藥物為分析對象，試樣經乙腈提取后，采用二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）測定，建立了高效液相色譜法快速篩查保健酒中14種那非違禁藥物的分析方法；采用HPLC-MS/MS法對于可疑那非類藥物殘留的陽性保健酒進行確證，提高檢測結果的準確性，以期規(guī)范那非類藥物合理使用。

表1 14種那非類藥物標準物質信息Table 1 Standard substance information of 14 kinds of nafil drug

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；LCMS-8080型液相色譜-串聯質譜儀：日本Shimadzu公司；JP-020S型超聲波清洗儀：廣州潔盟超聲波設備有限公司；MG-2200型氮吹儀：日本EYELA公司；MixPlus渦旋混合儀：合肥艾本森科學儀器有限公司；mini plus純水超純水一體機、BS-224S型電子天平：德國Sartorious公司。

那非類藥物標準物質（西地那非、高西地那非、羥基高西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基紅地那非、羥基硫代紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、乙酰伐地那非、他達那非、氨基他達那非）：上海安譜實驗科技股份有限公司，純度均≥98.0%，其它具體信息見表1；甲醇、甲酸、乙腈、乙酸銨：色譜純，德國Merck公司；其余試劑為分析純；試驗用水為超純水。

那非類藥物標準儲備液：分別稱取各那非類藥物標準物質0.1 g（精確至0.1 mg），用乙腈溶解，并轉移至100 mL容量瓶中定容，濃度為1.0 mg/mL。那非類藥物混合標準工作液：用乙腈將標準儲備液逐級稀釋至濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的標準系列混合工作液，臨用時現配。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse-plus C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相 A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；檢測波長：程序可變波長掃描（見表1）；流動相梯度洗脫條件見表2。

表2 流動相洗脫梯度Table 2 Elution gradient of mobile phase

1.3 質譜條件

電離方式：電噴霧正離子模式；檢測方式：多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣壓力：200 kPa；離子噴霧電壓：3 500 V；干燥氣溫度：330℃；干燥氣流速：8 L/min；定性離子對、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量具體見表3。

表3 那非類藥物的質譜參數Table 3 Mass spectrometric parameters of nafil drug

1.4 樣品前處理

準確稱取2 mL試樣于10 mL容量瓶中，加入5 mL乙腈，超聲30 min，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，上清液經0.22 μm有機尼龍膜過濾，濾液供上機測定。

1.5 標準曲線繪制

分別取 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 那非類藥物混合標準工作溶液進行HPLC測定，以混合標準工作溶液的質量濃度為橫坐標，以色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并以測得試樣色譜峰面積與標準曲線比較進行定量。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（DAD）對14種那非類藥物標準溶液在190 nm～800 nm范圍內進行紫外吸收色譜峰掃描，結合14種那非類藥物在不同波長掃描下的色譜峰紫外吸收情況，并為了消除基質干擾，依據出峰時間選擇可變波長進行檢測，經優(yōu)化后選擇290nm和230nm為檢測波長，其中西地那非、伐地那非、偽伐地那非、乙酰伐地那非、他達那非、氨基他達那非的檢測波長選擇290 nm，高西地那非、羥基高西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基紅地那非、羥基硫代紅地那非的檢測波長選擇230 nm（見表1）。以優(yōu)化的液相色譜條件對14種那非類藥物進行HPLC測定，結果表明，14種那非類藥物可獲得良好的色譜分離效果（見圖1）。

2.2 色譜柱的選擇

以色譜柱中14種那非類藥物的分離度、峰面積、保留時間等為評估參數，研究Diamonsil C18、Agilent XDB C18、Inertsil C18、Symmetry C18、Zorbax Eclipse-plus C18等不同廠家型號的色譜柱對保健酒中14種那非類藥物的分離情況。結果顯示：在相同色譜分析條件下，采用Zorbax Eclipse-plus C18色譜分析柱時，14種那非類藥物色譜峰可有效分離，保留時間適中，且色譜峰峰型對稱、峰面積響應值較高（見圖1）。故選擇Zorbax Eclipse-plus C18作為分析用色譜柱。

2.3 流動相的選擇

以Zorbax Eclipse-plus C18作為分析用色譜柱，研究甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-磷酸緩沖液等不同流動相對14種那非類藥物洗脫與分離效果。結果顯示：當使用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，經梯度洗脫后，14種那非類藥物可實現良好的分離效果，且色譜峰峰型尖銳對稱、高響應值（見圖1），故選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.4 基質效應

在色譜純乙腈、空白保健酒中分別加入適量那非類藥物混合標準溶液，使其終濃度依次為1.0 μg/mL（低濃度）、25.0 μg/mL（中濃度）、50.0 μg/mL（高濃度）等3種加標濃度試樣，按本文所建HPLC法進行測定，采用相對響應值法計算基質效應（Matrix Effect=B/A×100%，A為色譜純乙腈中被測那非類藥物的色譜峰響應值，B為空白保健酒中被測那非類藥物的色譜峰響應值）。結果顯示：在色譜純乙腈和空白保健酒兩種不同基質試樣中，14種被測那非類藥物的基質效應在92.0%～103.6%之間，平均值為96.2%，沒有顯著的基質效應（見表4）。

圖1 14種那非類藥物標準品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 14 kinds of nafil drug

表4 基質效應Table 4 Matrix effect %

2.5 質譜確證條件的優(yōu)化

由于保健酒大多數是一種中藥復方的酒劑，中藥材配料越多，基質成分越復雜，采用HPLC測定基質復雜的保健酒中那非類藥物非法添加可能會出現假陽性檢測結果。為了保障本文所建HPLC法測定結果的準確性，采用HPLC-MS/MS法對于可疑那非類藥物殘留的陽性保健酒進行進一步確證（見圖2）。結果顯示：在電噴霧正離子模式下，采用蠕動泵將1.0 μg/mL 14種那非類藥物混合標準溶液注入質譜檢測器中均可獲得響應信號較高的[M+H]+準分子離子峰（母離子）；優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量進行碰撞誘導裂解，獲得響應信號穩(wěn)定的碎片離子峰（子離子），14種那非類藥物的母離子、定量離子、定性離子具體見表3。

2.6 線性關系和檢出限

取基質相同的空白保健酒試樣，依次加入適量那非類藥物混合標準工作液使其質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL，按照本文所建 HPLC 法進行測定，繪制標準曲線。結果表明：14種那非類藥物在0.5 μg/mL～50.0 μg/mL范圍內，那非類藥物質量濃度（x）與其色譜峰峰面積（y）呈現良好的線性關系，相關系數 r2在 0.999 1～0.999 9之間（見表5）。

在空白試樣中添加一系列低濃度的那非類藥物混合標準工作液，以信噪比S/N=3計算方法檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比S/N=10計算方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。結果表明：LOD 在0.06 μg/mL～0.24 μg/mL 之 間，LOQ 在 0.20 μg/mL ～0.80μg/mL之間（見表5）。

2.7 回收率和精密度

在空白保健酒中分別加入適量那非類藥物混標，使其終濃度依次為 1.0 μg/mL（低濃度）、50.0 μg/mL（中濃度）、100.0μg/mL（高濃度）等 3種加標水平，按照本文所建HPLC法進行回收率和精密度試驗（表6）。從表6中可知：在加標濃度5.0mg/kg～50.0mg/kg范圍內，保健酒種14種那非類藥物平均加標回收率為94.1%～101.4%，相對標準偏差（RSD）為1.1%～3.7%。

圖2 14種那非類藥物總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of 14 kinds of nafil drug

表5 線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits

2.8 實際樣品的檢測

隨機選購市售10份保健酒，按照本文所建HPLC法進行14種那非類藥物非法添加快速篩查種類及其含量。結果顯示：10份保健酒中檢出那非類藥物陽性試樣3份，陽性檢出率為30%；西地那非、他達那非檢出率最高，其中西地那非添加量最高達218.3 mg/mL（見表7），這可能是由于西地那非是當前市場上流行的治療勃起功能障礙的口服速效處方藥，且價格低廉，質量有保證，故被不良廠商非法添加到保健酒種，以達到速效、高效的保健、滋補、壯陽、強身等功能宣稱廣告目的，從而進一步拓展銷路而非法牟利。

表7 實際樣品的檢測Table 7 Detection of actual samples

續(xù)表7 實際樣品的檢測Continue table 7 Detection of actual samples

3 結論

保健酒中的非法添加問題亟待解決，而保健酒的檢測分析是保證和提高品質的首要任務。本研究以14種那非類藥物為分析對象，試樣經乙腈提取后，采用二極管陣列檢測器（DAD）測定，建立了高效液相色譜法快速篩查保健酒中14種那非違禁藥物的分析方法；采用HPLC-MS/MS法對于可疑那非類藥物殘留的陽性保健酒進行進一步確證。結果表明：在0.5 μg/mL～50.0 μg/mL范圍內，14種那非類藥物質量濃度與其峰面積呈現良好的線性關系，相關系數r2在0.999 1～0.999 9 之間；LOD 在 0.06 μg/mL～0.24 μg/mL，LOQ 在0.20μg/mL～0.80μg/mL；平均回收率在94.1%～101.4%，RSD在1.1%～3.7%。該HPLC法測定保健酒中14種那非類藥物具有操作簡單、回收率高、精密度好、檢出限低等優(yōu)點，可為保健酒中那非類藥物非法添加監(jiān)督管理提供檢測技術，有效規(guī)范保健酒行業(yè)健康發(fā)展。