尿酸消膠囊微生物限度檢查法的建立和驗證

石 云，王曉妃

(1.普洱市食品藥品檢驗檢測中心質(zhì)保室，云南 普洱 665000； 2.普洱市食品藥品檢驗檢測中心藥品微生物室，云南 普洱 665000)

尿酸消膠囊是普洱市民族醫(yī)院開發(fā)研制的新制劑，用于預(yù)防及治療尿酸過高所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)腫痛，臨床效果顯著。由秦皮、倒心盾翅藤、虎杖和腎茶4味中藥制成，具有消炎利尿、祛風(fēng)勝濕、活血通絡(luò)和解熱止痛的功效，能舒緩關(guān)節(jié)和肌肉酸痛癥狀，緩解痛風(fēng)所致的腫痛。本研究根據(jù)《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查”[1]，建立微生物限度檢查方法。而秦皮[2]、虎杖[3]和腎茶[4]均有抑菌或抗菌作用，會對微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[5]，因此，必須進(jìn)行微生物限度檢查法的驗證，確保所建立的檢查方法能夠消除供試品的抑菌活性，保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠[6]。參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[7-8]，本研究對尿酸消膠囊微生物限度檢查法進(jìn)行驗證，建立適合該制劑的微生物限度檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

LMQ.C/3 260 J型立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海崇明實驗儀器廠)；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；BMJ-250型霉菌培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；T500型電子天平(美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司)；YJ-A型電動勻漿儀(浙江省臺州市椒江五星機(jī)械儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

尿酸消膠囊(普洱市民族醫(yī)院，規(guī)格：每粒裝0.35 g，批準(zhǔn)文號：滇藥制字(Z)20 140 010 J，批號：20160327、20160411和20160425)；氯化鈉(分析純，天津化學(xué)試劑廠)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、銅綠假單孢菌[CMCC(B)10104]、沙門菌[CMCC(B)50094]及黑曲霉[CMCC(F)98003]均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基及4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸埃希菌和沙門菌的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋至105～107，制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，加入至0.9%無菌氯化鈉溶液5 ml中，將孢子洗脫，采用適宜的方法，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液，備用[9]。

2.2 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

2.2.1 供試液的制備：取供試品10 g，加入45 ℃、pH為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，勻漿儀混勻，制成1∶10供試液，取1∶10供試液10 ml，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 ml，搖勻，制成1∶100供試液，備用。

2.2.2 試驗組：(1)平皿法。取1∶100供試液20 ml，加入制備好的各菌懸液0.2 ml，混勻，使每1 ml供試液中含菌數(shù)≤100 cfu，取該供試液1 ml注入平皿，立即傾注45 ℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；33 ℃下培養(yǎng)24～72 h，每日觀察并記錄(n=2)。(2)薄膜過濾法。取1∶100供試液1 ml加入到濾器中，用pH為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 ml，在最后1次沖洗液中加入≤100 cfu的試驗菌，將濾

膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24～72 h，每日觀察并記錄(n=2)。

2.2.3 菌液組：取pH為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替 1∶100供試液，按照“2.2.2”項下平皿法制備菌液組供試液，使每1 ml供試液中含菌數(shù)≤100 cfu，按照“2.2.2”項下平皿法和薄膜過濾法測定所加的試驗菌數(shù)(n=2)。

2.2.4 供試品對照組：取1∶100供試液10 ml，加入pH為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 ml，混勻，按照“2.2.2”項下平皿法和薄膜過濾法測定供試品菌數(shù)(n=2)。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 試驗組：(1)平皿法。取1∶10供試液20 ml，加入制備好的各菌懸液0.2 ml，混勻，使每1 ml 供試液中含菌數(shù)≤100 cfu，取該供試1 ml注入平皿，立即傾注45 ℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；23 ℃培養(yǎng)24～120 h，每日觀察并記錄(n=2)。(2)薄膜過濾法。取1∶10供試液1 ml加入到濾器中，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 ml，在最后1次沖洗液中加入≤100 cfu的試驗菌，將濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，23 ℃培養(yǎng)24～120 h，每日觀察并記錄(n=2)。

2.3.2 菌液組：取相應(yīng)稀釋液代替1∶10供試液，按照“2.3.1”項下平皿法制備菌液組供試液，使每1 ml供試液中含菌數(shù)≤100 cfu，再按“2.3.1”項下平皿法和薄膜過濾法測定所加的試驗菌數(shù)(n=2)。

2.3.3 供試品對照組：取1∶10供試液10 ml，加入0.1 ml相應(yīng)的稀釋液，混勻，按照“2.3.1”項下平皿法和薄膜過濾法測定供試品菌數(shù)(n=2)。

2.4 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗回收率

試驗菌株的回收率=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)，結(jié)果見表1。從表中可知，需氧菌總數(shù)計數(shù)采用平皿法時，試驗菌株(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌)的回收率<0.5；采用薄膜過濾法時，試驗菌株的回收率≥0.8；霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)采用平皿法時，試驗菌株(白色念珠菌、黑曲霉)的回收率≥0.5，采用薄膜過濾法時，試驗菌株的回收率≥0.8。需氧菌總數(shù)計數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)采用薄膜過濾法時回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)的規(guī)定[10]。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

2.5.1 耐膽鹽革蘭陰性菌：(1)供試液制備。取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml，勻漿混勻，在23 ℃培養(yǎng)2 h，備用。(2)試驗組。取供試液10 ml及<100 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，分別接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基100 ml中，混勻，33 ℃培養(yǎng)48 h后,劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板菌落生長情況。(3)陽性對照組。取稀釋液10 ml及<100 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，分別接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基100 ml中，按照本項下試驗組方法操作。(4)陰性對照組。取稀釋液10 ml接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基100 ml中，按照本項下試驗組方法操作。試驗結(jié)果見表2。

表2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法適用性試驗結(jié)果Tab 2 Results of the applicability test of the test method for gallbladder salt gram-negative bacteria

注：“+”表示有菌生長或陽性反應(yīng)；“-”表示無菌生長或陰性反應(yīng)

Note:“+” indicates the bacterial growth or positive reaction; “-” means the sterile growth or negative reaction

2.5.2 大腸埃希菌：(1)供試液制備。取“2.2.1”項下1∶10供試品液10 ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml，混勻，在33 ℃培養(yǎng)24 h。(2)試驗組。取培養(yǎng)后的供試液1 ml及<100 cfu的大腸埃希菌，接種至麥康凱液體培養(yǎng)基100 ml中，混勻，43 ℃培養(yǎng)48 h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)18～72 h，每日觀察平板菌落生長情況，挑取典型菌落接種至4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，在366 nm紫外光下觀察，同時用未接種的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基作本底對照，然后沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察液面是否呈玫瑰紅色。(3)陽性對照組。取稀釋液1 ml及<100 cfu的大腸埃希菌，接種至麥康凱液體培養(yǎng)基100 ml中，按照本項下試驗組方法操作。(4)陰性對照組。取稀釋液1 ml，接種至麥康凱液體培養(yǎng)基100 ml中，按照本項下試驗組方法操作。試驗結(jié)果見表3。

表3 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗結(jié)果Tab 3 Results of applicability test of Escherichia coli test method

注：“+”表示有菌生長或陽性反應(yīng)；“-”表示無菌生長或陰性反應(yīng)

Note:“+” indicates the bacterial growth or positive reaction; “-” means the sterile growth or negative reaction

2.5.3 沙門菌：(1)供試液制備。取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基200 ml，勻漿混勻，在33 ℃培養(yǎng)24 h，備用。(2)試驗組。取供試液0.1 ml及<100 cfu的沙門菌，接種至RV沙門增菌液體培養(yǎng)基10 ml中，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h，挑取典型菌落接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面，觀察斜面顏色變化。(3)陽性對照組。取稀釋液0.1 ml及<100 cfu的沙門菌，接種至RV沙門增菌液體培養(yǎng)基10 ml中，按照本項下試驗組方法操作。(4)陰性對照組。取稀釋液0.1 ml，接種至RV沙門增菌液體培養(yǎng)基10 ml中，按照本項下試驗組方法操作。試驗結(jié)果見表4。

上述結(jié)果顯示，采用常規(guī)方法即可檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，尿酸消膠囊進(jìn)行微生物限度檢查時，需氧菌總數(shù)計數(shù)方法應(yīng)采用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法可采用平皿法和薄膜過濾法，但應(yīng)優(yōu)先選用薄膜過濾法。

表4 沙門菌檢查方法適用性試驗結(jié)果Tab 4 Results of applicability test of salmonella test method

注：“+”表示有菌生長或陽性反應(yīng)；“-”表示無菌生長或陰性反應(yīng)

Note:“+” indicates the bacterial growth or positive reaction; “-” means the sterile growth or negative reaction

控制菌檢查可采用常規(guī)方法。

通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)，尿酸消膠囊雖含有一定的抑菌藥成分，但為選擇性抑菌，采取適宜的檢查方法，可消除樣品抑菌活性對實驗結(jié)果的影響。尿酸消膠囊為中藥復(fù)方制劑，微生物限度檢查是保證其質(zhì)量的重要指標(biāo)，可通過方法適用性試驗，建立適合于本品的檢驗方法，保證患者用藥安全。本品含藥材原粉，需氧菌總數(shù)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為104cfu/g，故選取1∶100供試液進(jìn)行方法驗證試驗[11]。

《中華人民共和國藥典》(2010年版)計數(shù)方法適用性試驗采用的是大腸埃希菌，且沙門菌檢查僅對含動物組織及動物類原藥材粉的口服制劑；而《中華人民共和國藥典》(2015年版)“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查”中，計數(shù)方法適用性試驗采用銅綠假單胞菌菌替代了大腸埃希菌，且擴(kuò)大了檢查的種類及范圍，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到了有效提高[12-13]。