Notch信號通路在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中的表達

潘 敏 王小康 趙 莎 林向飛 朱曉芳

銀屑病(psoriasis)是一種常見的慢性炎癥性疾病，典型表現(xiàn)為身體多處皮膚表面的鱗屑樣紅斑。在歐洲和美國，發(fā)病率接近2%，其他地區(qū)相對較少。2010年中國六省市銀屑病流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)中國人患病率為0.47%。在銀屑病發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞活化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是銀屑病發(fā)病機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對于銀屑病的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用[1-3]。研究表明，在銀屑病相關(guān)的信號通路中，Notch信號通路與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和凋亡與銀屑病發(fā)生關(guān)系密切，其中受體Notch1-4、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes1均為Notch信號通路的關(guān)鍵信號分子[4-6]。本研究通過建立咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，觀測Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1等在模型小鼠皮損和對照組小鼠皮損中的表達水平，從而進一步明確Notch信號通路在銀屑病發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，購買于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，飼養(yǎng)于SPF級動物室。

1.1.2 試劑及儀器 凡士林乳膏(南昌白云藥業(yè)有限公司)，5%咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)，薇婷護膚脫毛膏[利沾時家化(中國)有限公司]，抗Notch1-2、Jagged-1及Hes-1蛋白單克隆抗體(美國Abcam公司)，通用型二抗及抗體稀釋液(美國Abcam公司);Trizol RNA提取試劑((北京BioTeke公司);iScript cDNA kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國BioRad公司)；iTaqTMSYBR-Green Real Time PCR試劑盒(美國ABI公司)；DAB試劑盒(北京中衫金橋生物有限公司)；顯微鏡(OLYMPUS BX43)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 取BALB/c小鼠30只，隨機分為IMQ模型組20只和空白對照組10只，用戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，小心剃去小鼠背部中央?yún)^(qū)域的被毛，溫和型脫毛膏脫去毳毛，形成約2 cm×3 cm暴露區(qū)域。空白對照組：小鼠背部抹凡士林乳膏50 mg/cm2在脫毛部位，1次/d，連續(xù)7 d；IMQ模型組：小鼠背部抹按50 mg/cm2劑量均勻涂在脫毛部位，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.2 HE染色觀察皮損病理變化 于造模及處理后第8天小鼠拉頸處死后剪取小鼠皮損處皮膚甲醛固定，石蠟包埋，采用HE染色觀察IMQ模型組及空白對照組皮膚病理變化。

1.2.3 實時定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)檢測IMQ模型組及空白對照組皮膚受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的mRNA表達水平 用RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，用iScript cDNA kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。采用實時熒光定量PCR法進行擴增，引物序列見表1，β-actin作為內(nèi)參。按照iTaqTMSYBR-Green Real Time PCR試劑盒要求，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板進行兩步法PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 1 min；循環(huán)時95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行50個循環(huán)。檢測數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔΔCt法進行分析，檢測目的基因的相對表達量。

1.2.4 免疫組化觀察皮損處受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、Hes-1的蛋白表達水平 采用免疫組化SABC法檢測IMQ模型組及空白對照組皮損處受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、Hes-1的蛋白表達水平。常規(guī)石蠟包埋的皮膚組織脫蠟、水化，切片經(jīng)高壓抗原修復(fù)5 min，甲醇-過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，加入稀釋的一抗Notch1(1∶100)、Notch2(1∶100)、Jagged-1(1∶100)、Hes-1(1∶100)，4℃孵育過夜;滴加二抗，常溫孵育30 min； DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片，顯微鏡下觀察和拍片。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比( 5個×400倍隨機視野的陽性細(xì)胞百分比平均值) 及染色強度( 多數(shù)細(xì)胞的染色情況積分) 進行綜合評分。陽性細(xì)胞百分比:無陽性為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色強度按顏色深淺計分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項相加為綜合評分:0分為陰性，1～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗、Ridit分析法對數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMQ模型組及空白對照組皮膚病理變化 HE染色顯示，空白對照組皮膚菲薄，僅見2～3層形態(tài)正常的細(xì)胞；IMQ模型組小鼠表皮明顯增厚，表皮層細(xì)胞數(shù)量增加，表皮層向下延伸，可見明顯角化過度伴有角化不全，棘層細(xì)胞顯著增厚，真皮炎癥大量浸潤，表現(xiàn)為典型銀屑病樣改變(圖1)。

2.2 IMQ模型組較空白對照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的mRNA表達水平升高 IMQ模型組的Notch1的mRNA水平高于空白對照組，t=3.550，P<0.05；IMQ模型組的Notch2的mRNA水平高于空白對照組，t=3.575，P<0.05；IMQ模型組的Jagged-1的mRNA水平高于空白對照組，t=3.732，P<0.05；IMQ模型組的Hes-1的mRNA水平高于空白對照組，t=3.506，P<0.05(圖2)。

2.3 IMQ模型組較空白對照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的蛋白表達水平升高 在光鏡下，Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1陽性表達表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中出現(xiàn)淺黃色至棕黃色均勻或顆粒沉著。IMQ模型組皮損組織表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1的表達陽性率顯著高于空白對照組組織表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，見表2。Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1在IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽性表達以中度陽性、強陽性為主，在空白對照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達以陰性、弱陽性為主。見圖3～6。

表1 引物序列

圖1 IMQ模型組及空白對照組皮膚組織病理(HE，×100) 1a：空白對照組皮膚菲薄，僅見2～3層形態(tài)正常的細(xì)胞；1b：IMQ模型組小鼠表皮明顯增厚，表皮層細(xì)胞數(shù)量增加，表皮層向下延伸，可見角化過度、角化不全、棘層細(xì)胞顯著增厚，真皮炎癥細(xì)胞浸潤

圖3 IMQ模型組及空白對照組皮膚Notch1的表達(免疫組化，×100) 3a：空白對照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達以陰性、弱陽性為主；3b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽性表達以中度陽性、強陽性為主 圖4 IMQ模型組及空白對照組皮膚Notch2的表達(免疫組化，×100) 4a：空白對照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達以陰性、弱陽性為主；4b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽性表達以中度陽性、強陽性為主 圖5 IMQ模型組及空白對照組皮膚Jagged-1的表達(免疫組化，×100) 5a：空白對照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達以陰性、弱陽性為主；5b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽性表達以中度陽性、強陽性為主 圖6 IMQ模型組及空白對照組皮膚Hes-1的表達(免疫組化，×100) 6a：空白對照組表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達以陰性、弱陽性為主；6b：IMQ模型組皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的陽性表達以中度陽性、強陽性為主

表2 IMQ模型組及空白對照組皮膚Notch1、Notch2、Jagged-1、Hes-1的表達

3 討論

銀屑病是一種常見的以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生、角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤和新生血管形成為主要組織病理改變的慢性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑為典型皮損表現(xiàn)，其病因和發(fā)病機制非常復(fù)雜，目前為止仍未完全闡明[7]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號改變與銀屑病的表皮細(xì)胞過度增生、炎癥細(xì)胞浸潤和新生血管形成發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[8,9]。Notch信號傳導(dǎo)通路由4種受體(Notch1-4)、5種配體(Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4)和DNA結(jié)合蛋白3部分組成。Notch信號傳導(dǎo)過程中,Notch信號蛋白共經(jīng)歷了3次剪切過程。Notch基因編碼的Notch受體前體蛋白在核糖體合成以后，首先在高爾基體被Fringe糖基轉(zhuǎn)移酶切割為兩個片段，轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜后組成異二聚體形成成熟的Notch受體。當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后觸發(fā)Notch信號的活化，Notch受體相繼發(fā)生兩次蛋白水解后生成活性片段Notch細(xì)胞內(nèi)段(NICD)，NICD釋放入胞漿后由細(xì)胞內(nèi)體通過內(nèi)吞作用將轉(zhuǎn)運至核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制物CSL、Foxp3結(jié)合，進一步激活Bcl2、Hes1，Hes5等下游靶基因家族，從而促進細(xì)胞分化[10]。因此，受體Notch1、Notch2、配體Jagged、目標(biāo)基因Hes1均為Notch信號通路的關(guān)鍵信號分子。

咪喹莫特(imiquimod, IMQ)，是一種很強的免疫激活劑，臨床上常用作由人乳頭狀瘤引起的生殖道和肛周疣的局部治療。IMQ是Toll 樣受體7(Toll-like receptor7，TLR7)的激動劑，當(dāng)其被激活后，能引起免疫調(diào)控因子的改變，進一步產(chǎn)生炎性反應(yīng)及損傷。當(dāng)用咪喹莫特涂抹動物皮膚后，出現(xiàn)鱗屑、紅斑、皮膚褶皺及增厚，呈現(xiàn)銀屑病樣皮損[11]。因此咪喹莫特皮損模型也是目前熱點研究的銀屑病樣皮損動物模型之一[12]。

我們的預(yù)實驗提示IMQ外用誘導(dǎo)銀屑病樣皮損在連續(xù)用藥后第7天達到高峰，然后逐漸改善。因此我們以IMQ造模小鼠，同時建立空白對照組，在試驗第8天采集試驗所需標(biāo)本，研究發(fā)現(xiàn)，IMQ可成功誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型，RT-PCR結(jié)果提示IMQ模型組較空白對照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的mRNA表達水平升高，免疫組化結(jié)果提示IMQ模型組較空白對照組皮膚的受體Notch1、Notch2、配體Jagged-1、目標(biāo)基因Hes-1的蛋白表達水平升高。因此可以認(rèn)為，IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表達增加， Notch信號通路傳導(dǎo)活化信號的能力增強,可以推斷Notch信號通路活化參與了銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗的研究對象為咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠模型，實驗結(jié)果與國外關(guān)于銀屑病病人血液、皮損的Notch表達方面的研究結(jié)果趨勢一致[13,14]，證實了咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠模型作為銀屑病動物模型的可靠性。本實驗就銀屑病相關(guān)的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行了初步研究，但是銀屑病的病因和發(fā)病機制非常復(fù)雜，多種信號通路異常參與其中，Notch信號通路的其他因子以及其與其他類型信號通路(如NF-κB、SMAD等)在銀屑病發(fā)病機制方面的串話關(guān)系仍有待進一步研究。