MMP-12及其抑制因子TIMP-1在基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌患者皮損中的表達(dá)

司海鵬 高麗麗 王劍蓉

基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma, BCC)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)統(tǒng)稱為非黑色素瘤皮膚癌(non-melanomatous skin cancer, NMSC)，兩者皆起源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，具有較高的發(fā)生率，給患者帶來身體和精神的雙重壓力[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12，也稱巨噬細(xì)胞金屬彈力酶)能夠廣泛降解如IV型膠原、纖連蛋白、層黏連蛋白、玻連蛋白、硫酸軟骨素和肝素鈉等細(xì)胞外基質(zhì)，據(jù)報(bào)道，MMP-12具有抗腫瘤發(fā)生和促腫瘤發(fā)生的雙重效應(yīng)[2,3]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)可以特異性地結(jié)合MMPs進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是MMP-12主要的抑制劑。多數(shù)研究表明除了乳腺癌、結(jié)腸癌等常見腫瘤[4,5]，在皮膚惡性黑色素瘤及皮膚鱗狀細(xì)胞癌中[6-8]MMP表達(dá)增高并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，TIMP對MMP具有較強(qiáng)抑制作用，而在NMSC中二者的表達(dá)及意義報(bào)道較少，本研究應(yīng)用免疫組化法檢測正常皮膚、BCC患者皮膚及SCC患者皮膚組織中MMP-12及TIMP-1的表達(dá)，探討其與NMSC發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2017年12月間我院門診及住院患者的基底細(xì)胞癌及皮膚鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本共56例，均經(jīng)組織病理證實(shí)。其中BCC患者31例，年齡36～83歲，平均61.25歲，男17例，女14例；頭面部24例，軀干部7例。SCC患者25例，年齡29～82歲，平均61.2歲，男15例，女10例；其中頭頸部10例，外生殖器8例，四肢5 例，軀干2例；按分化程度分為高分化組10例，中分化組8例，低分化組7例。另取我院皮膚科及外科手術(shù)切除正常皮膚20例作為對照。

1.2 試劑 鼠抗人多克隆抗體MMP-12、鼠抗人單克隆抗體TIMP-1購自廣州萊德爾公司。枸櫞酸抗原修復(fù)液、DAB顯色液均購自武漢博士德。

1.3 免疫組化 每個組織塊進(jìn)行3 μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、H2O2(過氧化氫)封閉、熱修復(fù)后PBS洗滌3次，血清封閉，滴加一抗，一抗37℃孵育1 h后，PBS清洗3次，滴加二抗試劑，最后經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染，用已有陽性片子作陽性對照，使用不加一抗片子作為陰性對照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀物質(zhì)判為陽性，并按著色強(qiáng)弱分級：無著色為0分，淺黃色劃為1分，深黃色為2分，棕褐色為3分。隨機(jī)選取5個視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比均值：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。將上述兩項(xiàng)評分標(biāo)準(zhǔn)相加可得表達(dá)強(qiáng)度積分：<2分為陰性(-)，≥2分且<3分為弱陽性(+)，≥3分且<4分為陽性(++)，≥4分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料分別采用方差分析和卡方檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MMP-12與TIMP-1蛋白表達(dá)情況 MMP-12在正常對照表皮中幾乎不表達(dá)，在真皮區(qū)域的成纖維樣細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)。31例BCC中MMP-12陽性表達(dá)為14例(45.2%)，呈弱陽性彌散于癌巢。25例SCC患者中陽性表達(dá)20例(80%)，陽性細(xì)胞在癌巢內(nèi)表達(dá)，陽性較強(qiáng)者主要位于癌巢中心，癌巢增殖區(qū)域反而著色略淡，也可觀察到癌巢周圍間質(zhì)中部分巨噬細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞有少量陽性表達(dá)。TIMP-1在正常對照表皮中呈現(xiàn)大量陽性表達(dá)，31例BCC患者中有21例呈陽性表達(dá)(67.7%)。25例SCC患者中TIMP-1陽性表達(dá)15例(60%)，高分化的SCC可見癌巢區(qū)域大片的表達(dá)，而在低分化者中表達(dá)減弱。BCC、SCC與正常組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1及圖1。

表1 MMP-12與TIMP-1在正常組織、BCC及SCC中的陽性表達(dá)

注：*與正常組比較，P<0.05

2.2 不同分化程度SCC中MMP-12與TIMP表達(dá)情況 MMP-12蛋白表達(dá)水平隨著腫瘤分級的增高而增高，即在低分化鱗癌的表達(dá)明顯高于高分化組，而TIMP-1蛋白表達(dá)與之相反，在高分化鱗癌的表達(dá)明顯高于低分化，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 SCC不同分化程度中MMP-12與TIMP-1表達(dá)情況

注：與對應(yīng)分類比較，*P<0.05

3 討論

皮膚癌是迄今造成最普遍危害的癌癥之一，根據(jù)其發(fā)生的細(xì)胞和臨床表現(xiàn)來命名，最常見的三種類型是基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌及惡性黑色素瘤?；准?xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌都來自表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，每年全球非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)發(fā)生兩百多萬例，據(jù)估算，在未來30年發(fā)生率可能增加一倍。BCC的發(fā)生率占NMSC發(fā)生率的80%～85%，生長緩慢，極少轉(zhuǎn)移到其他器官[9]。SCC發(fā)生占NMSC的15%～20%，侵襲性強(qiáng)，如未得到及時治療則會侵犯周圍正常的皮膚、皮下組織及肌肉，引起較為嚴(yán)重的損害[10]，NMSC即使未發(fā)生轉(zhuǎn)移也會造成明顯的毀損，造成生理、心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，降低人們的生活質(zhì)量[11]。這二種腫瘤均為老年人多發(fā)，BCC女性患者較多，SCC男性患者略多[12]，最常見于頭面部等曝光部位，目前，NMSC治療首選手術(shù)切除，但是易復(fù)發(fā)，SCC和BCC發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的一個主要原因是基底膜完整性被破壞。

MMPs主要由單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞合成分泌，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分和基底膜。研究表明，在腫瘤細(xì)胞的惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移表型中MMPs為高表達(dá)狀態(tài)[13]。在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和口腔癌等也發(fā)現(xiàn)MMP-2及MMP-9表達(dá)上調(diào)[14]。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，MMPs可以通過破壞局部組織的正常生理結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤生長和發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞各類生長因子的分泌,加快腫瘤細(xì)胞的增殖。此外MMPs還可協(xié)助腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[15]及促進(jìn)腫瘤的新生血管迅速形成[16]。MMP-12是MMPs家族中的一員，又稱巨噬細(xì)胞金屬彈性酶(HME)，一方面它在分解纖溶酶原和V型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的過程中，可促進(jìn)產(chǎn)生抑制血管生成的血管抑素和內(nèi)抑素，從而抑制腫瘤的生長和侵襲[2]；另一方面，在分解膠原和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)過程中，能誘導(dǎo)MMP-2及MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)血管生成及促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[3]，所以MMP-12在腫瘤進(jìn)展上的作用是雙向的。在皮膚癌中，相對正常皮膚，MMP-12在惡性黑色素瘤中表達(dá)增加，與其侵襲性相關(guān)[17]。在SCC和BCC的研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-12表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，SCC中MMP-12的表達(dá)明顯高于BCC，提示MMP-12的表達(dá)水平在兩者中存在差異，與其侵襲性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中MMP-12表達(dá)的免疫組化結(jié)果與前人實(shí)驗(yàn)[18]類似，BCC中的MMP-12陽性表達(dá)45.2%，SCC患者中陽性表達(dá)80%，在SCC及BCC具有明顯差異；而且MMP-12蛋白表達(dá)水平隨著腫瘤分級的增高而增高，即在低分化鱗癌的表達(dá)明顯高于高分化組，表明了MMP-12與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力關(guān)聯(lián)密切。

TIMPs由成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞以及成骨細(xì)胞等分泌產(chǎn)生。TIMPs對MMPs活性的抑制作用是控制MMPs活性的重要機(jī)理，TIMPs主要通過控制腫瘤的生長與增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成及細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑制腫瘤功效。在增殖的抑制及對凋亡的促進(jìn)方面，報(bào)道有所矛盾[14]。多項(xiàng)研究表明在皮膚癌、肺癌、大腸癌等惡性腫瘤中，TIMP-1陽性表達(dá)率明顯增高，其過度表達(dá)則預(yù)后不良的報(bào)道較多[19]。而在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中經(jīng)半定量RT-PCR法檢測，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中TIMP-1表達(dá)下降[6，20]。本實(shí)驗(yàn)中TIMP-1陽性表達(dá)在BCC患者中有67.7%，在SCC患者中有60%，以上結(jié)果表明在SCC中TIMP-1的表達(dá)較BCC少，而且在高分化鱗癌的表達(dá)明顯高于低分化組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明隨著侵襲度的增加，TIMP-1表達(dá)逐漸減少。

綜上所述，本文就MMP-12、TIMP-1 在NMSC中表達(dá)做了初步的研究。其中MMP-12及其抑制劑與SCC的組織分化程度和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為皮膚SCC早期轉(zhuǎn)移和侵襲性的一個指標(biāo)，而在BCC中其機(jī)理還有待探索，可能與其他MMPs的表達(dá)具有關(guān)聯(lián)性。