基于GC和GC-MS技術(shù)檢測果酒中的脂肪酸

王儒珍，陸燕，曹建平，唐麗婷

（廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名 525000）

果酒中游離脂肪酸對于其風(fēng)味具有非常重要的影響[1,2]。近年來，由于果酒越來越受到重視，有關(guān)果酒中香氣成分的研究也較多，但是針對酒品中脂肪酸檢測分析的研究較少[3～5]。目前，常用的脂肪酸提取方法有固相萃取和液-液萃取，其中液液萃取法因可通過改變pH環(huán)境來控制被萃取酸的去向被廣泛應(yīng)用[6,7]。

脂肪酸是熱敏性物質(zhì)，沸點(diǎn)高，在高溫下易發(fā)生脫酸、裂解、聚合等副反應(yīng)造成損失，需將其衍生為甲酯后進(jìn)行檢測。常用的甲酯化方法有堿處理法、酸處理法、重氮甲烷法、三氟化硼法、等方法[8]。其中硫酸-甲醇酯化法因甲酯化效果較好被廣泛應(yīng)用[9]。近年來，用于脂肪酸檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[10]和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[11]。氣相色譜法有分離度好、檢測靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，但對相對分子質(zhì)量大、不易揮發(fā)的脂肪酸分析存在局限性，且要購買昂貴的標(biāo)準(zhǔn)品對比分析，大大限制了其應(yīng)用。GC-MS的優(yōu)勢在于有成熟的商品化標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫，可對未知化合物進(jìn)行快速檢索和鑒定，但用于定量時(shí)步驟較為繁瑣耗時(shí)。這兩種測試方法各有利弊，根據(jù)需要選擇GC-MS法定性，GC法定量分析，對果酒中脂肪酸含量進(jìn)行測定[12]。

本研究采用有機(jī)溶劑液-液萃取法提取并富集果酒中的脂肪酸，用硫酸-甲醇甲酯化處理，采用GC-MS結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對果酒中的脂肪酸聯(lián)合定性，并用GC法分析脂肪酸含量。以期通過甲酯化處理，減少長碳鏈脂肪酸在GC色譜柱中高溫裂解情況，從而更全面的檢測出果酒中所含脂肪酸種類及含量，為果酒中脂肪酸含量檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考依據(jù)。

1 主要材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸（色譜標(biāo)準(zhǔn)），上海國藥；十五烷酸、軟脂酸、十七烷酸、硬脂酸、十九酸、二十四烷酸（色譜標(biāo)準(zhǔn)），F(xiàn)luka；甲醇、二氯甲烷、正己烷（色譜純），美國天地；硫酸、鹽酸、無水硫酸鈉（優(yōu)級純），上海國藥；桑椹酒、櫻桃酒、藍(lán)莓酒、青梅酒、枇杷酒、葡萄酒、荔枝酒、龍眼檸檬酒均為自釀。

GCMS-QPZ100 plus氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津；Agilent 7890B氣相色譜儀，美國Agilent；MX5電子天平，美國METTLER TOLEDO。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 工作曲線標(biāo)液的配制

精確稱取一定量的己酸（C6∶0）、庚酸（C7∶0）、辛酸（C8∶0）、壬酸（C9∶0）、癸酸（C10∶0）、月桂酸（C12∶0）、肉豆蔻酸（C14∶0）、十五烷酸（C15∶0）、軟脂酸（C16∶0）、十七烷酸（C17∶0，內(nèi)標(biāo)）、硬脂酸（C18∶0）、十九酸（C19∶0）、二十四烷酸（C24∶0）于燒杯中，用正己烷溶解并定容至50 mL，配成0.2 mg/mL的混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL混合酸標(biāo)準(zhǔn)于圓底燒瓶，加入2 mL正己烷、2 mL甲醇、1 mL濃硫酸，恒溫回流酯化。冷卻后加入2 mL正己烷，轉(zhuǎn)入試管并加入2 mL去離子水，振搖，靜止分層后取上層有機(jī)相1 mL上機(jī)測試。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精確稱取一定量十七烷酸，用正己烷溶解并定容至50 mL，配成1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。準(zhǔn)確量取100 μL、1.0 mg/mL內(nèi)標(biāo)溶液入圓底燒瓶，加入2 mL正己烷、2 mL甲醇、1 mL濃硫酸，恒溫回流酯化。冷卻后加入2 mL正己烷，轉(zhuǎn)入試管并加入2 mL去離子水，振搖，轉(zhuǎn)移有機(jī)相，水相用2 mL正己烷萃取兩次，合并有機(jī)相過無水硫酸鈉，留過濾液，用氮吹儀濃縮，定容至2 mL。將上述溶液用正己烷依次稀釋到2、4、8、20、100倍幾個(gè)數(shù)量級，配制成不同梯度濃度的內(nèi)標(biāo)溶液上機(jī)測試。

1.3 樣品處理

1.3.1 脂肪酸的提取

取 10 mL 酒樣，加入 30 μL 1.0 mg/mL C17∶0內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩，用10%氫氧化鉀溶液調(diào)pH值大于12，加入正己烷-二氯甲烷（2∶1）溶液6 mL，振蕩5 min，超聲輔助分層，棄去有機(jī)相，保留水相，重復(fù)萃取 3次。

水相用10%鹽酸溶液調(diào)pH值小于2，再加入正己烷-二氯甲烷（2∶1）有機(jī)溶液6 mL萃取，振蕩5 min，超聲輔助分層，收集有機(jī)相，如此萃取3次，合并有機(jī)相。

1.3.2 脂肪酸的酯化

在上述收集的有機(jī)相中加入5 mL去離子水，反萃取2次，棄去水相，有機(jī)相過無水硫酸鈉（500 ℃煅燒2 h）柱，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶（加沸石），加入2 mL甲醇、1 mL濃硫酸于水浴回流酯化處理一點(diǎn)時(shí)間后，取下燒瓶，冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL分液漏斗，加入2 mL去離子水，振搖，棄水相，保留有機(jī)相，如此重復(fù)兩次，有機(jī)相過無水硫酸鈉柱后，用氮吹儀濃縮至 0.5 mL，備GC和GC-MS進(jìn)樣。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 GC分析條件

色譜柱HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測器FID溫度：310 ℃；起始柱溫50 ℃（保持2 min），以10 ℃/min的速率升至200 ℃后；再以5 ℃/min升至290 ℃（保持5 min）；載氣：N2，流量1.0 mL/min；空氣流量：400 mL/min；氫氣流量：30 mL/min；尾吹流量：20 mL/min。

1.4.2 GC-MS條件

色譜柱 Rxi-5siLMS(30 m×0.25 μm×0.25 μm)；無分流進(jìn)樣；無分流時(shí)間0.8 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；起始柱溫50 ℃，以10 ℃/min的速率升至200 ℃后；再以5 ℃/min升至290 ℃（保持5 min）。離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑切割時(shí)間2 min；EI電離源；能量70 eV；掃描方式Scan。

1.5 游離脂肪酸的測定

1.5.1 定性分析

在最佳儀器條件下，采用GC-MS測試經(jīng)甲酯化處理后的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品或果酒樣品，根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)的總離子流譜圖，結(jié)合GC-MS譜庫檢索對測試酒樣中的脂肪酸組分進(jìn)行定性分析。

1.5.2 定量分析

在最佳儀器條件下，采用GC測試經(jīng)甲酯化處理后的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)混合樣品系列，繪制工作曲線。結(jié)合GC-MS定性分析結(jié)果，采用外標(biāo)法結(jié)合內(nèi)標(biāo)法對果酒樣品進(jìn)行定量分析，利用工作曲線進(jìn)行相應(yīng)脂肪酸的含量計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用origin 8.0作圖，Excel 2016處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 甲酯化溫度

圖1 甲酯化溫度對果酒中脂肪酸分析結(jié)果的影響Fig.1 Effect of methyl esterification temperature on the analysis of FAs in fruit wine

取混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL（共5份），在不同甲酯化溫度條件下，按“1.3”進(jìn)行樣品前處理；在最佳儀器條件下，采用GC進(jìn)行測試，考察甲酯化溫度對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果見圖1。

由圖1可見，甲酯化溫度在50～90 ℃變化時(shí)，C6∶0至 C12∶0檢出的峰面積變化不大；而 C14∶0至 C24∶0的峰面積在甲酯化溫度70～80 ℃之間明顯增大。各個(gè)脂肪酸的峰面積都相對較大。這可能是由于脂肪酸的甲酯化反應(yīng)是一個(gè)吸熱的可逆反應(yīng)過程[13]。升溫有利于提高脂肪酸的甲酯化效率；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，甲酯化效率最好；此后繼續(xù)提升反應(yīng)溫度，體系中脂肪酸的脫羧及其它副反應(yīng)增強(qiáng)，致使正向反應(yīng)速率降低，甚至發(fā)生逆反應(yīng)。綜合分析，選擇脂肪酸甲酯化溫度為80 ℃。

2.1.2 甲酯化時(shí)間

取混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL（共5份），在不同甲酯化反應(yīng)時(shí)間條件下，按“1.3”進(jìn)行樣品前處理，甲酯化溫度為80 ℃；在最佳儀器條件下，采用GC進(jìn)行測試，考察甲酯化時(shí)間對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 甲酯化時(shí)間對對果酒中脂肪酸分析結(jié)果的影響Fig.2 Effect of methyl esterification time on the analysis of FAs in fruit wine

由圖2可知，當(dāng)甲酯化反應(yīng)時(shí)間在10～60 min范圍內(nèi)變化時(shí)，C6∶0至C10∶0的脂肪酸的峰面積響應(yīng)值變化不大，而C12∶0至C24∶0的脂肪酸的峰面積響應(yīng)值在甲酯化反應(yīng)時(shí)間為40 min內(nèi)，上升幅度較大，此后延長反應(yīng)時(shí)間，各物質(zhì)的峰面積響應(yīng)值上升趨勢并不明顯。這可能是由于反應(yīng)時(shí)間對短碳鏈脂肪酸的甲酯化效率影響不大，反應(yīng)時(shí)間較少時(shí)，C12∶0以上脂肪酸甲酯化不完全，因此，選擇甲酯化時(shí)間為40 min。

2.1.3 前處理方法的優(yōu)化

表1 前處理方法對果酒中脂肪酸分析結(jié)果的影響Table 1 Effect of pretreatment methods on FAs analysis in fruit wine

以藍(lán)莓酒為例，方法一見“1.3樣品處理”。

方法二：取4 mL酒樣，加入10 μL 1.0 mg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻后用10%鹽酸溶液調(diào)pH＜2.0，用6 mL正己烷-二氯甲烷（2∶1）溶劑連續(xù)萃取3次，振蕩5 min結(jié)合超聲輔助分層，留有機(jī)相。水相用10%氫氧化鉀溶液調(diào)pH＞12.0后，用6 mL正己烷-二氯甲烷（2∶1）連續(xù)萃取三遍，超聲輔助分層，水相用 10%鹽酸調(diào)pH＜2.0后，再用6 mL正己烷-二氯甲烷（2∶1）連續(xù)萃取3次，超聲輔助分層后合并有機(jī)相。其余處理步驟同方法一。采用氣相色譜儀檢測，對比兩種方法前處理后各脂肪酸的含量（此處僅取檢出的幾種脂肪酸進(jìn)行比較），結(jié)果見表1。由表1可知，采用方法一萃取的果酒中脂肪酸含量測試結(jié)果遠(yuǎn)高于方法二。這可能是由于水相的pH值影響萃取平衡[14]。方法一先采用KOH堿性溶液萃取，使更多的脂肪酸呈解離態(tài)，以減緩后續(xù)衍生化反應(yīng)的劇烈程度，避免劇烈反應(yīng)放熱對游離脂肪酸的破壞。

2.2 線性范圍及檢出限

表2 果酒中脂肪酸的方法檢出限及線性范圍Table 2 Detection limit and linear range of FAs in fruit wine

在最佳儀器條件下，采用GC測試“1.2.1”節(jié)制備的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制工作曲線，并取空白溶液，連續(xù)測定11次，根據(jù)LOD=3*σ/S計(jì)算檢出限。結(jié)果見表2。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

取10 mL果酒樣品，按照方法一進(jìn)行前處理，在最佳儀器條件下測試，以內(nèi)標(biāo)法結(jié)合外標(biāo)法進(jìn)行定量分析（加入內(nèi)標(biāo)的量為1.0 mg/L，加標(biāo)量見表3），計(jì)算各脂肪酸含量，并計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率。結(jié)果表明，該方法分析各脂肪酸含量的RSD均在5.0%以下，平均回收率均大于 87%（87.3%～110.6%），該方法有較好的準(zhǔn)確度及精密度。詳細(xì)結(jié)果見表3。

2.4 果酒中脂肪酸定性定量分析

取8種果酒樣品，在最佳前處理?xiàng)l件下，經(jīng)過萃取濃縮和甲酯化處理后，用GC-MS和GC結(jié)合內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法對其中的脂肪酸進(jìn)行定性和定量分析（由于標(biāo)準(zhǔn)品昂貴，部分脂肪酸參照鄰近脂肪酸的定量參數(shù)，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析）。分析結(jié)果見表4。

由表4可知，8種果酒中共檢出28種脂肪酸，各果酒中所含脂肪酸的種類相近，其中，軟脂酸的含量相對較高，且其含量在各果酒脂肪酸總量中所占比例皆在25%左右。

8種果酒中桑椹酒中檢出的脂肪酸總量最高，達(dá)78.21 mg/L。這可能是由于桑椹果中所含某些功能性成分的量較其他幾種水果稍多。此外，采用原料不同以及釀造過程中，選用的酵母的微生物種群、生產(chǎn)工藝上的差異，也是導(dǎo)致各種果酒中脂肪酸含量差別較大的重要因素。

表3 果酒中脂肪酸的平行試驗(yàn)及回收率Table 3 Thereplicate measurements and recoveries of FAs in fruit wine

硬脂酸 2.32 0.09 2.45 0.11 2.42 0.11 2.45 0.10 2.44十九酸 2.10 0.02 2.24 0.02 2.24 0.03 2.24 0.03 2.31二十四烷酸 2.00 0.03 1.80 0.05 1.80 0.05 1.80 0.05 1.81

表4 8種果酒中脂肪酸含量分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistical analysis of the results of FAs content in eight kinds of fruitwine

注：“-”表示沒有未檢出。

3 結(jié)論

采用有機(jī)溶劑液-液萃取方法提取和富集 8種果酒中的脂肪酸，并優(yōu)化了萃取處理方法，用硫酸-甲醇法甲酯化處理。采用GC-MS結(jié)合部分脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品對8種果酒中的脂肪酸進(jìn)行定性分析，用GC測量，內(nèi)標(biāo)法結(jié)合外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，該方法具有較好的準(zhǔn)確與精密度，滿足檢測要求。此外，樣品通過堿性條件萃取，經(jīng)甲酯化處理后，有效減少了長碳鏈脂肪酸在高溫下裂解的情況，能更全面的檢測出果酒中脂肪酸的種類及含量。