超聲處理制備小麥醇溶蛋白膠體顆粒Pickering乳液及其表征

吳滋靈，周福珍，尹艷，尹壽偉

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食物蛋白工程研究中心，廣東廣州 510640）（2.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007）

Pickering乳液是一類由固體顆粒穩(wěn)定的無皂（surfactant-free）乳液，其最大的優(yōu)勢是耐受聚并（coalescence）[1]。英國 Hull大學(xué)的 Binks教授對Pickering乳液的研究在理論上做出較大的貢獻(xiàn)，建立了Pickering乳液的界面解吸能(ΔE)與三相接觸角(θ)、顆粒半徑(r)和界面張力(γ)之間的關(guān)系[2]。通常尺寸大于10 nm的膠體粒子的解吸能比熱運(yùn)動(dòng)能(～kBT)大3個(gè)數(shù)量級以上，其界面吸附可認(rèn)為是不可逆的[3]。無機(jī)顆粒穩(wěn)定的Pickering最為傳統(tǒng)，其形成機(jī)理、性能及微觀結(jié)構(gòu)研究最為深入。最近，膠體科學(xué)家開始探索新型Pickering乳液，如環(huán)境響應(yīng)Pickering乳液、可逆的Pickering乳液。食品級Pickering乳液是食品膠體研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和挑戰(zhàn)，兼具活性物輸送、低熱量(calorie reduction)和質(zhì)地改良(texture modification)的功能[4,5]。2013年，英國Leeds大學(xué)的Dickinson教授撰文指出探尋合適食品級 Pickering乳化劑是食品膠體領(lǐng)域的挑戰(zhàn)[6]。英國Leeds大學(xué)的Murray教授在食品級Pickering乳液構(gòu)建方面開展重要的探索工作，利用辛基琥珀酸淀粉顆粒構(gòu)建了微米級的水包油型Pickering乳液，此類乳液能穩(wěn)定數(shù)月[7]。比較而言，以食物蛋白顆粒制備的Pickering乳液的更具優(yōu)勢，也更具挑戰(zhàn)。多數(shù)食物蛋白不能直接作為Pickering乳化劑，如大豆蛋白等通過界面吸附、展開和重排形成傳統(tǒng)的乳液。針對這類蛋白質(zhì)，可以通過熱聚集、酶或化學(xué)交聯(lián)合成蛋白膠體顆粒，以制備Pickering乳液。華南理工大學(xué)唐傳核教授在大豆蛋白膠體顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液研究方面較為突出[8]。以自組裝醇溶蛋白顆粒為乳化劑制備 Pickering乳液是食品膠體領(lǐng)域的前沿。我們研究小組利用zein膠體顆粒構(gòu)建了穩(wěn)定的食品級Pickering乳液，并通過界面輸送制備出抗氧化的Pickering乳液[9]。

小麥醇溶蛋白(gliadin)是一類兩親性的疏水蛋白，溶劑極性改變會(huì)引發(fā)由兩親性驅(qū)動(dòng)的gliadin分子自組裝形成納/微尺度的膠體顆粒。因此，小麥醇溶蛋白顆粒在構(gòu)建食品級的Pickering乳液方面，具有廣闊的前景。前期研究表明，不經(jīng)過修飾的小麥醇溶蛋白顆粒制備的Pickering乳液只能穩(wěn)定數(shù)天，通過靜屏蔽途徑調(diào)控 gliadin膠體顆粒表面潤濕性，制備出穩(wěn)定的Pickering乳液，并揭示了相關(guān)構(gòu)效機(jī)理[10,11]。本研究利用超聲的乳化以制備穩(wěn)定Pickering乳液，系統(tǒng)研究了不同超聲功率對Pickering乳液形成、穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)的影響，探討了乳液微結(jié)構(gòu)、流變學(xué)特性與乳液穩(wěn)定性間的關(guān)系，為食品級Pickering乳液在新型營養(yǎng)物質(zhì)輸送載體及食品結(jié)構(gòu)修飾基料應(yīng)用提供了新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 材料

小麥谷朊粉、玉米油，市購；無水乙醇，購自南京試劑化學(xué)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

超聲乳化機(jī)，美國OMNI公司；高速剪切機(jī)(T10)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀記磁力攪拌器，德國IKA公司；冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；Zeta電位及納米粒度儀Nano-ZS，英國Malvern公司；粒徑分布儀（Mastersizer 3000），英國 Malvern公司；激光共聚焦顯微鏡，德國 Leica公司；HAKKE RS600流變儀，德國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥醇溶蛋白膠體顆粒的制備

小麥醇溶蛋白的提取參考 Duclairoir等報(bào)道的方法[12]，稍加改動(dòng)。以市購谷朊粉為原料，經(jīng)70%的乙醇提純冷凍干燥后，得到小麥醇溶蛋白。采用經(jīng)典的反溶劑納米沉淀法制備小麥醇溶蛋白膠體顆粒[13]。將小麥醇溶蛋白溶解在70%（V/V）的乙醇中，得到2.5%（m/V）的溶液。在反溶劑過程，水/醇相體積比為2.5∶1。將小麥醇溶蛋白溶液緩緩倒入 1%冰乙酸的水溶液中，邊倒邊均質(zhì)（6000 r/min 4 min）。所得懸浮液在 40 ℃水浴下旋蒸以除去乙醇和部分水，最后得到2.0%（m/V）小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）溶液。置于4 ℃冰箱冷藏，備用。

1.2.2 小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）的粒度和Zeta-電位的測定

采用Zetasizer Nano ZS測定膠體顆粒的粒度及電位。測量溫度為25 ℃，顆粒分散系數(shù)為1.45，分散劑為水，水的分散系數(shù)（dispersant RI）為1.330。樣品濃度為0.1～0.2%。

1.2.3 Pickering乳液的制備

以 2%（m/V）小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）作為乳液劑制備Pickering乳液。玉米油以油相，油水比為1∶1（V/V），用高速分散機(jī)IKAT10經(jīng)20000 r/min均質(zhì)2 min制備得到粗乳液。之后采用超聲處理進(jìn)行二次乳化，功率大小分別為0（對照）、20、40、60、80%和100。脈沖70%，超聲時(shí)間6 min。

1.2.4 乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

通過觀察放置時(shí)間中乳析層的變化來評價(jià)乳液的穩(wěn)定性。若乳析層不變，則說明乳液穩(wěn)定性好；若乳析層不斷改變，并伴隨漏油破乳等現(xiàn)象，則說明乳液穩(wěn)定性不好。使用Canon DIGITAL IXUS 110 IS照相機(jī)對乳液進(jìn)行拍照。

1.2.5 乳液的粒徑分布測定

采用 Mastersizer 3000粒度分布儀測定乳液的粒徑及分布。以水為分散劑，顆粒折射率和吸收率分別為1.470和0.001，分散劑折射率：1.330。采用體積平均直徑（D4,3）來表征乳液的粒度及分布。

1.2.6 乳液的微觀結(jié)構(gòu)：激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察

采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)研究乳液的微結(jié)構(gòu)。樣品染色方法是：1 mL樣品中用40 μL尼羅紅和尼羅藍(lán)混合熒光染液染色；分別在488 nm激發(fā)尼羅紅，在633 nm激發(fā)尼羅藍(lán)；掃描頻率100 Hz，掃描密度為1024×1024。使用LAS AF Lite軟件進(jìn)行圖像處理。

1.2.7 乳液的流變學(xué)特性

流變學(xué)特性通過HAAKE RS600流變儀測定。乳液樣品在測試過程中保持恒溫 25 ℃，使用直徑為27.83 mm的平板，其間隙為1 mm。

應(yīng)力掃描：設(shè)置應(yīng)力范圍為0.1 Pa～1000 Pa，固定頻率為1 Hz。

頻率掃描：根據(jù)應(yīng)力掃描結(jié)果，選擇在線性粘彈區(qū)域進(jìn)行頻率掃描。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)力為1 Pa，頻率范圍為 0.1 Hz～10 Hz。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得結(jié)果均是取3次測量的平均值，且結(jié)果采用SPSS 13.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析，顯著性差異采用95%的置信區(qū)間進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）的Zeta-電位、粒度及外觀

表1 小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）的粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和Zeta-電位Table 1 Size and zeta potentials of gliadin colloid particles(GCPs)

圖1新制(a)和1 h后(b)小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）的外觀Fig.1 Appearance photographs of the GCPs dispersions: (a)freshly prepared and (b) after one hour

表1給出了GCPs的粒徑、多分散指數(shù)（PDI）、Zeta-電位的大小，圖1給出了GCPs的外觀?？梢钥吹?，GCPs粒子的PDI較大（0.755±0.113），呈多分散性分布；粒徑為120.1±2.3 nm，Zeta-電位為24.25±1.55 mV。放置1 h后，小麥醇溶蛋白膠體顆粒仍呈半透明狀態(tài)。分散液中膠體顆粒的穩(wěn)定性主要是由整體核電荷決定的，在酸性環(huán)境(～pH 30)GCPs顆粒間的靜電排斥力非常高，足以能夠保證分散液的穩(wěn)定。但是穩(wěn)定的Pickering乳液的形成有賴于顆粒將的相互作用力，構(gòu)建較為完整的界面結(jié)構(gòu)。

2.2 Pickering乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

圖2 不同超聲功率的Pickering乳液的外觀Fig.2 Appearance photographs of the Pickering emulsions as a function of ultrasonic power

儲(chǔ)藏穩(wěn)定性是一個(gè)乳狀液非常關(guān)鍵的品質(zhì)參數(shù)。乳析是乳液聚集或聚并的先兆，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性主要是通過乳析指數(shù)來評定。圖2顯示了不同超聲功率下GCPs穩(wěn)定的 Pickering乳液的外觀性質(zhì)。新鮮制備的乳液（圖2a）是均勻的，沒有出現(xiàn)乳析或分層現(xiàn)象。在儲(chǔ)藏過程中由于重力的作用，乳液中的水層在下方，富含油脂的乳液在上方。超聲功率為 0、20%的乳液在儲(chǔ)藏3 d后便出現(xiàn)黃色小油滴，說明乳滴開始破裂，變得不穩(wěn)定而漏油。而超聲功率為40%、60%、80%、100%的乳液（圖 2b）只是析出了少部分水（乳析指數(shù)在 20%左右），乳液沒有出現(xiàn)漏油現(xiàn)象，也就是說乳液仍保持穩(wěn)定。而且超聲功率為40%～100%的乳液在儲(chǔ)藏高達(dá)5個(gè)月之久后，仍保持穩(wěn)定，而且可以實(shí)現(xiàn)倒置（圖3）。這表明該乳液可能具有一定的粘彈性和凝膠特性，形成的乳液較為穩(wěn)定。

圖3 放置5個(gè)月后的Pickering乳液外觀（功率為40%）Fig.3 Appearance photographs of the Pickering emulsions of 40% ultrasonic power after 5 months

2.3 Pickering乳液的粒徑

圖4 超聲功率40%的GCPs穩(wěn)定的Pickering乳液的粒徑分布Fig.4 Size distribution of GCPs stabilized Pickering emulsions fabricated by 40% ultrasonic power as a function of time

從表2可以看出，新制乳液經(jīng)過超聲處理后平均粒徑隨著超聲功率的增大而減小。超聲功率在20%的乳液比不經(jīng)過超聲的乳液粒徑減少了超過 50%以上（從10.7 μm減小到4.7 μm）。新制乳液超聲功率為60%以上的乳液平均粒徑在2 μm以內(nèi)。

乳液在放置了兩個(gè)月后，超聲功率為0%和20%的乳液破乳（破乳無法檢測粒徑），這與之前乳液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果是一致的。而超聲功率在40%以上的乳液粒徑比新制乳液粒徑稍微變大，但增大的幅度很小（大概增加了1 μm），乳液粒徑保持在5 μm尺度內(nèi)，一般低內(nèi)相乳液的粒徑在10 μm左右，且乳液的粒徑越小，則表明乳液越穩(wěn)定，所以本實(shí)驗(yàn)制備的超聲乳液具有較強(qiáng)的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。圖4是超聲功率40%的乳液不同時(shí)間放置后的粒徑分布圖。從圖中，我們可以明顯地觀察到，隨著時(shí)間的增加，功率40%的乳液的粒徑大小仍一致，且分布較均勻，這表明超聲處理的乳液沒有破壞乳液的結(jié)構(gòu)，乳液在經(jīng)過長時(shí)間的保存后，其結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性。

表2 不同超聲功率下Pickering乳液的粒徑大小Table 2 Droplet size of GCPs stabilized Pickering emulsions as a function of ultrasonic power

2.4 Pickering乳液的微觀結(jié)構(gòu)

圖5 Pickering乳液的CLSM圖（標(biāo)尺：10 μm）Fig.5 Selected CLSM images (Scale bar: 10 μm) of GCPEs as a function of ultrasonic power

研究乳液的微觀結(jié)構(gòu)（如界面結(jié)構(gòu)、顆粒分布、連續(xù)相網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等）有助于理解乳液的形成及乳液的穩(wěn)定性。激光共聚焦顯微技術(shù)（CLSM）能夠清楚地觀察到以上微觀結(jié)構(gòu)。圖5顯示出部分典型的超聲處理后的GCPEs圖像。綠色表示的是用尼羅紅染色玉米油，紅色表示的是用尼羅藍(lán)染色小麥醇溶蛋白膠體顆粒（GCPs）。從圖a我們可以觀察到，不經(jīng)過超聲的乳液滴一顆一顆均勻分布，連續(xù)相中紅色（蛋白質(zhì)）明顯，這表明上到油滴表明的蛋白質(zhì)較少；而圖b是超聲功率為40%的乳液CLSM圖，從圖中可知，乳液油滴更小，而且呈現(xiàn)絮凝聚結(jié)狀，這可能是因?yàn)榻?jīng)過超聲處理后，超聲過程輸入的能量有助于更多的蛋白固體顆粒吸附到油水界面，從而穩(wěn)定更多更小的油滴，而且乳液滴絮凝聚結(jié)明顯但不合并，呈現(xiàn)如圖所示的結(jié)構(gòu)，表明該結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的。

2.5 Pickering乳液的流變學(xué)特性

由固體顆粒穩(wěn)定的乳液通常情況下具有較好的流變學(xué)特性，對乳液的穩(wěn)定性有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)通過頻率掃描和應(yīng)力掃描表征乳液的流變學(xué)特性，其中，G?和G?分別表示彈性模量和粘性模量，兩者的交點(diǎn)表示其臨界應(yīng)力（乳液在該作用點(diǎn)下發(fā)生凝膠-溶膠的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化）。圖6是超聲功率為80%乳液的應(yīng)力掃描（a）和頻率掃描（b）圖。從圖a中可看到，在線性粘彈區(qū)域內(nèi)，G?（4000 Pa）明顯高于 G?（640 Pa），這表明該乳液具有類似于固體的粘彈性能，繼續(xù)加大壓力到超過100 Pa，才出現(xiàn)臨界交點(diǎn)，這表明乳液的粘彈性較強(qiáng)。從圖中可知，該超聲乳液的G?在3500～4000 Pa范圍內(nèi)，而以往的研究表明，具有較好凝膠特性的高內(nèi)相Pickering乳液的G?在1000 Pa左右，這表明經(jīng)過超聲的乳液具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，具有高內(nèi)相乳液的粘彈性能和凝膠性。圖b是超聲功率為80%的乳液頻率掃描圖，從圖中可知，G?明顯高于G?，G?表現(xiàn)出較弱的頻率依賴性，且頻率掃描的G?在2500～3000 Pa之間，表現(xiàn)了乳液較強(qiáng)的凝膠特性，其頻率掃描結(jié)果與其應(yīng)力掃描結(jié)果一致。

從前面該乳液的激光共聚焦乳液結(jié)構(gòu)分析中我們知道，油滴經(jīng)過超聲后被剪切為粒徑更小的液滴，更多的蛋白顆粒吸附到油水界面上，而且由于蛋白顆粒對油滴的穩(wěn)定作用，使得鄰近的乳液滴絮凝粘結(jié)而不合并，油滴與油滴之間通過固體蛋白顆粒被固定下來，蛋白形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且由于油滴的固定使乳液失去流動(dòng)性，因此在流變學(xué)特性實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)類固體的粘彈性和凝膠特性，使得乳液滴可以穩(wěn)定很長時(shí)間。

圖6 Pickering乳液（超聲功率80%）的G'、G''隨掃描頻率和應(yīng)力的變化Fig.6 Variations of storage (G') and loss (G'') moduli with the stress (a) and frequency (b) for the Pickering emulsionsproduced with 80% ultrasonic power

3 結(jié)論

3.1 本文利用反溶劑納米沉淀技術(shù)制備出納米尺度的小麥醇溶蛋白膠體顆粒(GCPs)，采用簡單低成本的超聲乳化制備出小麥醇溶蛋白穩(wěn)定的Pickering乳液，放置5個(gè)月以上仍舊保持穩(wěn)定。

3.2 本文初步探討不同超聲功率對乳液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明超聲功率為40%以上的乳液具有小的粒徑以及更好的穩(wěn)定性；通過激光共聚焦（CLSM）研究蛋白顆粒、油滴在界面、體相的分布情況以及乳液的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明經(jīng)過超聲處理，油滴被剪切為更小的液滴，超聲過程中輸入的能量有助于蛋白顆粒的吸附，更多的蛋白顆粒吸附到油水界面從而穩(wěn)定界面，且蛋白形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，油滴絮凝聚結(jié)而不合并，賦予了乳液更優(yōu)異的穩(wěn)定性、流變學(xué)的性能。