樟芝口服液的解酒護肝效果研究

黃桂東，彭家偉，梁舒妍，馮結(jié)鏵，區(qū)錫敏，鐘先鋒

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東佛山 528000）

適量飲酒有促血液循環(huán)，通經(jīng)活絡(luò)，祛風(fēng)除濕等功效[1]。但急性大量飲酒通常會造成人體急性肝損傷；引起諸多不適，如惡心、嘔吐、精細運動能力受損、意識模糊和情緒不穩(wěn)定等，且易導(dǎo)致意外事故（如車禍）發(fā)生，嚴重的甚至導(dǎo)致急性死亡[2]。隨著人們生活方式與節(jié)奏的變化，我國飲酒人數(shù)不斷增加，每年由于過量飲酒引起的疾病越來越多，如引起精神障礙、胃潰瘍以及脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等疾?。皇车腊⒏伟┌l(fā)病率的升高可能也與飲酒有關(guān)[3]。飲酒帶來的負面影響已嚴重威脅到人民的健康和社會的和諧穩(wěn)定。因此，研發(fā)有效的解酒護肝產(chǎn)品仍是學(xué)者著重關(guān)注的課題。

樟芝（Antrodia camphorata），又名牛樟菇、牛樟芝，屬于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、樟芝種、多年生蕈菌類[4]，是臺灣地區(qū)特有的一類十分稀少的藥食兩用真菌[5]。近年來，關(guān)于樟芝的研究報道越來越多，學(xué)者發(fā)現(xiàn)樟芝的活性成分主要有三萜類化合物[6]、多糖[7]和安卓奎諾爾[8]等。樟芝具有多種藥理活性，如護肝、抗癌、抗炎和抑菌等功效[9,10]。樟芝通常被看作是護肝良藥，Liu等[11]人發(fā)現(xiàn)樟芝處理組能明顯降低酒精損傷后谷丙轉(zhuǎn)氨酶（aspartateamino transferase，AST）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（alanineamino transferase，ALT）的水平，提高SOD和GSH-Px的水平；Chiu等[12]人發(fā)現(xiàn)樟芝能降低大鼠肝細胞因CCl4慢性損傷而造成的AST、ALT水平升高，能明顯降低肝脂過氧化水平和羥脯氨酸含量。但樟芝子實體有“臺灣森林紅寶石”之稱，價格昂貴。為了節(jié)約成本，促進其推廣，本實驗室通過液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)樟芝菌，制備了樟芝口服液。擬通過動物實驗，探究自制樟芝口服液的解酒護肝功效。以期為樟芝口服液的推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物：SPF級KM種小鼠，雄性標(biāo)重，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心，合格證號：SCXK（粵）2016-0041。

試劑：AST試劑盒、ALT試劑盒、ADH試劑盒、ALDH試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、純水1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖水24 g、果糖20 g、胰蛋白胨20 g、磷酸氫二鉀0.1 g、純水1000 mL。

實驗用藥：樟芝口服液，由實驗室制得；陽性對照藥為金樽海王片，深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司。

實驗用酒：56°紅星二鍋頭酒，北京紅星股份有限公司。

設(shè)備：VCX800超聲波破碎儀，美國SONICS公司；Epoch2微孔板分光光度計，美國伯騰儀器有限公司；7200型可見光分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；ME2002電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SY-1220恒溫水浴鍋，美國精騏有限公司；ALLEGRA -64R臺式高速大容量離心機，美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樟芝口服液的制備

樟芝口服液工藝流程：樟芝活化與培養(yǎng)→樟芝提取液制備→原料調(diào)配→均質(zhì)→分裝→滅菌→成品

樟芝活化與培養(yǎng)：（1）菌種活化：挑取斜面保藏的樟芝菌種于種子培養(yǎng)基，25 ℃恒溫振蕩器140 r/min培養(yǎng)10 d，活化2～3代。（2）發(fā)酵培養(yǎng)：接活化后的種子培養(yǎng)液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫振蕩器 140 r/min培養(yǎng)10 d。

樟芝提取液制備：（1）樟芝發(fā)酵液處理：將發(fā)酵完畢的樟芝用4層紗布過濾，得樟芝發(fā)酵液，再經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，得樟芝液。（2）樟芝菌絲體處理：將過濾的菌絲體，用純水洗滌干凈，于60 ℃烘至恒干，然后用研缽磨至粉狀，于超聲粉碎儀中提取，反應(yīng)條件為提取功率40 W、提取時間30 min、料液比1∶20。將提取液于8000 r/min離心10 min，取上清液?；旌仙鲜稣林ヒ喊l(fā)酵液與菌絲體提取上清液，制得樟芝提取液。

樟芝口服液：樟芝提取液 80%（V/V，三萜類化合物含量0.4 mg/mL）、谷胱甘肽2 g/L、?；撬? g/L、水蘇糖2 g/L調(diào)配制得，然后分裝至10 mL棕色西林瓶。

殺菌：殺菌條件為100 ℃，2 min。

1.2.2 小鼠醉酒模型的建立

隨機選取小鼠30只小鼠，分3組，每組10只，分別以0.10 mL/10 g、0.15 mL/10 g、0.20 mL/10 g的劑量灌胃 56°紅星二鍋頭。以小鼠“翻正反射”消失與恢復(fù)判定醉酒與醒酒[13]，記錄小鼠的醉酒耐受時間、醉酒時間、運動情況和死亡情況等。

1.2.3 樟芝口服液解酒實驗

1.2.3.1 動物分組

隨機選取小鼠50只，分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、低劑量樟芝口服液組和高劑量樟芝口服液組，每組10只。（樟芝口服液為高劑量樟芝口服液，稀釋4倍后為低劑量樟芝口服液。）

1.2.3.2 給藥方法

小鼠禁食、不禁水12 h后，進行試驗。（1）空白對照組：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的生理鹽水，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的生理鹽水；（2）模型對照組：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的生理鹽水，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的56°紅星二鍋頭；（3）陽性對照組：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的金樽海王片溶液，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的56°紅星二鍋頭；（4）低劑量樟芝口服液組：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的低劑量樟芝口服液，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的56°紅星二鍋頭；（5）高劑量樟芝口服液組：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的高劑量樟芝口服液，然后 30 min后再灌胃 0.15 mL/10 g的56°紅星二鍋頭。

1.2.3.3 觀察指標(biāo)

灌酒后觀察并記錄小鼠醉酒耐受時間、醉酒時間、運動情況及死亡等情況。

1.2.3.4 生化指標(biāo)的測定

灌胃酒精4 h后，所有小鼠摘眼球取血，3000 r/min離心10 min分離血清；動物采血后頸椎脫臼處死，解剖取出肝臟，取肝臟右葉0.1 g，在0.9%的冰生理鹽水，用組織勻漿器制備成0.1 g/mL的肝組織勻漿，3000 r/min，4 ℃冷凍離心15 min，取上清液冷藏、備用。血清按照ALT試劑盒、AST試劑盒說明書操作，測定血清ALT、AST的含量；肝組織上清液按照ADH、ALDH試劑盒說明書操作，測定肝勻漿ADH、ALDH的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠醉酒模型的建立

以“翻正反射”的消失與恢復(fù)判定小鼠的醉酒與醒酒。由表1的結(jié)果顯示，低劑量組中有4只出現(xiàn)醉酒現(xiàn)象，仍有6只未醉；高劑量組全部出現(xiàn)醉酒現(xiàn)象，但有3只死亡；中劑量組全部出現(xiàn)醉酒現(xiàn)象，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，醉酒耐受時間為 14.3±5.8 min、醉酒時間為 258.3±25.2 min。

鄭立發(fā)[3]等人采用不同劑量 56°紅星二鍋頭白酒建立小鼠醉酒模型時，結(jié)果表明0.15 mL/10 g為較佳致醉量，動物可明顯致醉且無大量死亡。這與本模型的中劑量組結(jié)果一致，因此選用0.15 mL/10 g的劑量作為小鼠醉酒用劑量。

表1 小鼠醉酒模型試驗結(jié)果Table 1 Results of mice drunk model test

2.2 樟芝口服液對小鼠醉酒情況的影響

不同組別處理對小鼠醉酒結(jié)果是不同的。由表 2的結(jié)果顯示，陽性對照組中有2只未出現(xiàn)“翻正反射”消失，即沒醉；而高劑量組有3只未醉。模型組中，小鼠的醉酒耐受時間最短（14.1±5.2 min）、醉酒時間最長（230.0±22.3 min）。與模型對照組相比，低劑量組能顯著縮短小鼠的醉酒時間（p＜0.05）；高劑量組能顯著延長小鼠醉酒耐受時間，縮短醉酒時間（p＜0.01），醉酒耐受時間分別從 14.1±5.2 min延長到 27.9±7.9 min，醉酒時間從 230.0±22.3 min縮短至 161.7±38.0 min。張明昊[14]等人研究葛花解醒湯對小鼠醉酒模型解酒護肝作用時，翻正實驗?zāi)Ｐ蛯φ战M的醉酒耐受時間與醉酒時間分別為20.1±3.2 min與222.4±5.8 min，葛花解醒湯組的醉酒耐受時間與醉酒時間分別為32.2±3.7 min與176.5±6.7 min。該結(jié)果與本試驗的高劑量組相似，綜上表明，樟芝口服液具有一定的防醉、解酒功效。

表2 各試驗組小鼠醉酒耐受時間、醉酒時間的情況Table 2 Tolerance time and drunken time of each groups (n=10, ˉx±s)

2.3 樟芝口服液對小鼠血清ALT、AST的影響

根據(jù)ALT、AST試劑盒操作指示，測定各組小鼠血清中ALT、AST的活力。表3結(jié)果顯示，急性灌胃酒精會造成小鼠血清中ALT、AST水平升高，模型對照組 ALT、AST水平均比空白對照組有顯著提高（p＜0.01），分別從19.94±7.27 U/L 升高到56.34±9.60 U/L，從36.57±6.84 U/L升高到69.57±11.88 U/L，說明造模成功。與模型組相比，低劑量組的ALT、AST水平稍有下降，但差異不顯著；而高劑量組的ALT水平顯著降低（p＜0.01），從 56.34±9.60 U/L 降低到42.35±12.29 U/L，AST水平也顯著降低（p＜0.05），從69.57±11.88 U/L降低到51.86±15.04 U/L。

ALT和AST水平的高低是衡量機體組織功能是否正常的重要指標(biāo)，正常情況下在血液中維持一個正常的范圍[15]。當(dāng)攝入急性或毒性物質(zhì)，如酒精、四氯化碳、有機磷等會引起肝細胞的損傷或壞死，ALT、AST就會大量釋放到血液當(dāng)中[16]，引起含量升高。而高劑量樟芝口服液有抑制因酒精損傷而導(dǎo)致的ALT、AST水平升高的作用，表明樟芝有一定的護肝功效。該結(jié)果與李俊鵬[17]在牛樟芝膠囊對大鼠四氯化碳肝損傷的保護作用的結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)樟芝膠囊能顯著降低因四氯化碳損傷而導(dǎo)致的 ALT、AST水平的升高。

組別 ALT/(U/L) AST/(U/L)空白對照組 19.94±7.27 36.57±6.84模型對照組 56.34±9.60** 69.57±11.88**陽性對照組 41.59±9.90** ## 56.14±10.06 ** #低劑量組 49.53±7.17** 62.57±9.47**高劑量組 42.35±12.29** ## 51.86±15.04**#

注：與空白組對比，*p＜0.05表示差異顯著，**p＜0.01表示差異極顯著；與模型組對比，#p＜0.05表示差異顯著，##p ＜0.01表示差異極顯著。

2.4 樟芝口服液對小鼠肝組織勻漿 ADH、ALDH的影響

根據(jù)ADH、ALDH試劑盒的操作指示，測定小鼠肝組織勻漿中ADH、ALDH活力。表4結(jié)果顯示，攝入酒精會引起機體ADH、ALDH水平升高，與模型組對比，高劑量組能顯著提高ADH水平（p＜0.01），從6.21±1.91 U/mg prot升高到 9.82±3.36 U/mg prot。另外低劑量組雖能提高ADH水平，但效果不顯著；對于ALDH，與模型對照組相比，高劑量組能顯著提高其ALDH水平（p＜0.05），從454.15±119.18 U/mg升高到454.15±119.18 U/mg。低劑量組在提高ALDH水平上無顯著差異。

ADH和ALDH是酒精代謝過程中的關(guān)鍵酶[18]，其水平高低是衡量解酒快慢的重要指標(biāo)。高劑量樟芝口服液能在機體攝入酒精的情況下，提高 ADH和ALDH的水平，該結(jié)果與劉瑩[19]研究野葛花解酒作用機理中，野葛花粗提物通過提高ADH、ALDH活力方式具有解酒作用相同。表明樟芝口服液具有解酒的功效。

表4 樟芝口服液對小鼠肝勻漿ADH、ALDH的影響Table 4 Effect of oral liquid on the activity of ADH, ALDH in mice liver homogenates(n=10, ˉx±s)

3 結(jié)論

本研究以實驗室自制樟芝口服液對KM種小鼠進行灌胃試驗，通過比較不同試驗組小鼠的醉酒耐受時間、醉酒時間，以及測定小鼠肝組織中ADH、ALDH的活力，探究其對小鼠急性酒精肝損傷的保護作用。研究初步表明，高劑量（0.2 mL/10 g）樟芝口服液能顯著延長小鼠醉酒耐受時間和縮短醉酒時間，并且能顯著降低因急性酒精中毒而導(dǎo)致的ALT、AST水平升高，表明樟芝有一定的護肝功效。ADH和ALDH含量的高低是機體代謝酒精快慢的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)，攝入酒精會引起機體ADH、ALDH水平的升高，而高劑量樟芝口服液能更進一步提高試驗小鼠肝組織中ADH、ALDH的水平（p＜0.01、p＜0.05），由此推斷樟芝口服液的解酒功效是由促進機體合成更多 ADH、ALDH而實現(xiàn)的，表明本試驗中自制樟芝口服液具有一定的解酒護肝功效，其原理可能是與促進 ADH、ALDH表達水平升高有關(guān)。